മയോസിൻ ഹെവി ചെയിനിനപ്പുറമുള്ള മനുഷ്യന്റെ അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ വൈവിധ്യം.

nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി. നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ബ്രൗസർ പതിപ്പിന് പരിമിതമായ CSS പിന്തുണ മാത്രമേ ഉള്ളൂ. മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, ഏറ്റവും പുതിയ ബ്രൗസർ പതിപ്പ് ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ ഇന്റർനെറ്റ് എക്സ്പ്ലോററിൽ അനുയോജ്യതാ മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക). കൂടാതെ, തുടർച്ചയായ പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, ഈ സൈറ്റ് സ്റ്റൈലുകളും ജാവാസ്ക്രിപ്റ്റും ഇല്ലാത്തതായിരിക്കും.
സ്കെലെറ്റൽ പേശി എന്നത് പ്രധാനമായും മയോഫിബ്രിലുകൾ അടങ്ങിയ ഒരു വൈവിധ്യമാർന്ന ടിഷ്യു ആണ്, മനുഷ്യരിൽ ഇവയെ സാധാരണയായി മൂന്ന് തരങ്ങളായി തിരിച്ചിരിക്കുന്നു: ഒന്ന് "സ്ലോ" (ടൈപ്പ് 1) രണ്ട് "ഫാസ്റ്റ്" (ടൈപ്പ് 2A, 2X). എന്നിരുന്നാലും, പരമ്പരാഗത മയോഫിബ്രിൽ തരങ്ങൾക്കിടയിലും അവയ്ക്കുള്ളിലും ഉള്ള വൈവിധ്യം ഇപ്പോഴും മോശമായി മനസ്സിലാക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. ഹ്യൂമൻ വാസ്റ്റസ് ലാറ്ററലിസിൽ നിന്നുള്ള 1050, 1038 വ്യക്തിഗത മയോഫിബ്രിലുകളിൽ ഞങ്ങൾ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്, പ്രോട്ടിയോമിക് സമീപനങ്ങൾ യഥാക്രമം പ്രയോഗിച്ചു. പ്രോട്ടിയോമിക് പഠനത്തിൽ പുരുഷന്മാരും ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക് പഠനത്തിൽ 10 പുരുഷന്മാരും 2 സ്ത്രീകളും ഉൾപ്പെടുന്നു. മയോസിൻ ഹെവി ചെയിൻ ഐസോഫോമുകൾക്ക് പുറമേ, മൾട്ടിഡൈമൻഷണൽ ഇന്റർമയോഫിബ്രിൽ വേരിയബിലിറ്റിയുടെ ഉറവിടങ്ങളായി മെറ്റബോളിക് പ്രോട്ടീനുകൾ, റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീനുകൾ, സെല്ലുലാർ ജംഗ്ഷണൽ പ്രോട്ടീനുകൾ എന്നിവ ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു. കൂടാതെ, മന്ദഗതിയിലുള്ളതും വേഗതയേറിയതുമായ നാരുകളുടെ ക്ലസ്റ്ററുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടും, ടൈപ്പ് 2X നാരുകൾ മറ്റ് ഫാസ്റ്റ്-ട്വിച്ച് നാരുകളിൽ നിന്ന് ഫിനോടൈപ്പിക്കലി വേർതിരിച്ചറിയാൻ കഴിയില്ലെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. കൂടാതെ, നെമാലിൻ മയോപ്പതികളിലെ മയോഫൈബർ ഫിനോടൈപ്പിനെ വിവരിക്കാൻ മയോസിൻ ഹെവി ചെയിൻ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള വർഗ്ഗീകരണം പര്യാപ്തമല്ല. മൊത്തത്തിൽ, ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ മൾട്ടിഡൈമൻഷണൽ മയോഫൈബർ വൈവിധ്യത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, വ്യതിയാന സ്രോതസ്സുകൾ മയോസിൻ ഹെവി ചെയിൻ ഐസോഫോമുകൾക്കപ്പുറത്തേക്ക് വ്യാപിക്കുന്നു.
സെല്ലുലാർ വൈവിധ്യം എല്ലാ ജൈവ സംവിധാനങ്ങളുടെയും അന്തർലീനമായ സവിശേഷതയാണ്, ഇത് കോശങ്ങളുടെയും കോശങ്ങളുടെയും വ്യത്യസ്ത ആവശ്യങ്ങൾ നിറവേറ്റുന്നതിന് കോശങ്ങളെ പ്രത്യേകമാക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നു.1 സ്കെലിറ്റൽ പേശി നാരുകളുടെ വൈവിധ്യത്തെക്കുറിച്ചുള്ള പരമ്പരാഗത വീക്ഷണം മോട്ടോർ ന്യൂറോണുകൾ ഒരു മോട്ടോർ യൂണിറ്റിനുള്ളിലെ ഫൈബർ തരം നിർവചിക്കുന്നു, കൂടാതെ ഫൈബർ തരം (അതായത്, മനുഷ്യരിൽ ടൈപ്പ് 1, ടൈപ്പ് 2A, ടൈപ്പ് 2X) മയോസിൻ ഹെവി ചെയിൻ (MYH) ഐസോഫോമുകളുടെ സവിശേഷതകളാൽ നിർണ്ണയിക്കപ്പെടുന്നു എന്നതാണ്.2 ഇത് തുടക്കത്തിൽ അവയുടെ pH ATPase അസ്ഥിരതയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതായിരുന്നു,3,4 പിന്നീട് MYH ന്റെ തന്മാത്രാ പ്രകടനത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതായിരുന്നു.5 എന്നിരുന്നാലും, വ്യത്യസ്ത അനുപാതങ്ങളിൽ ഒന്നിലധികം MYH-കളെ സഹ-പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന "മിശ്രിത" നാരുകളെ തിരിച്ചറിയുകയും തുടർന്ന് സ്വീകരിക്കുകയും ചെയ്തതോടെ, അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളെ വ്യത്യസ്ത ഫൈബർ തരങ്ങളായിട്ടല്ല, ഒരു തുടർച്ചയായി കൂടുതലായി കാണുന്നു.6 ഇതൊക്കെയാണെങ്കിലും, മയോഫൈബർ വർഗ്ഗീകരണത്തിനുള്ള പ്രാഥമിക വർഗ്ഗീകരണമായി ഈ ഫീൽഡ് ഇപ്പോഴും MYH-നെ വളരെയധികം ആശ്രയിക്കുന്നു, ആദ്യകാല എലി പഠനങ്ങളുടെ പരിമിതികളും ഗണ്യമായ പക്ഷപാതങ്ങളും സ്വാധീനിച്ച ഒരു വീക്ഷണമാണിത്, അതിന്റെ MYH എക്സ്പ്രഷൻ പ്രൊഫൈലുകളും ഫൈബർ തരങ്ങളുടെ ശ്രേണിയും മനുഷ്യരിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമാണ്.2 വ്യത്യസ്ത മനുഷ്യ അസ്ഥികൂട പേശികൾ ഒരു വൈവിധ്യമാർന്ന ഫൈബർ തരങ്ങൾ.7 വാസ്റ്റസ് ലാറ്ററലിസ് ഒരു ഇന്റർമീഡിയറ്റ് (അതിനാൽ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന) MYH എക്സ്പ്രഷൻ പ്രൊഫൈലുള്ള ഒരു മിശ്രിത പേശിയാണ്.7 കൂടാതെ, സാമ്പിളിംഗ് എളുപ്പം ഇതിനെ മനുഷ്യരിൽ ഏറ്റവും കൂടുതൽ പഠിച്ച പേശിയാക്കുന്നു.
അതിനാൽ, ശക്തമായ "ഒമിക്സ്" ഉപകരണങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ വൈവിധ്യത്തെക്കുറിച്ചുള്ള പക്ഷപാതമില്ലാത്ത അന്വേഷണം നിർണായകമാണ്, പക്ഷേ വെല്ലുവിളി നിറഞ്ഞതുമാണ്, ഭാഗികമായി അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ മൾട്ടിന്യൂക്ലിയേറ്റഡ് സ്വഭാവം കാരണം. എന്നിരുന്നാലും, ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്സ്8,9, പ്രോട്ടിയോമിക്സ്10 സാങ്കേതികവിദ്യകൾ സമീപ വർഷങ്ങളിൽ വിവിധ സാങ്കേതിക പുരോഗതികൾ കാരണം സംവേദനക്ഷമതയിൽ ഒരു വിപ്ലവത്തിന് വിധേയമായിട്ടുണ്ട്, ഇത് സിംഗിൾ-ഫൈബർ റെസല്യൂഷനിൽ അസ്ഥികൂട പേശികളുടെ വിശകലനം അനുവദിക്കുന്നു. തൽഫലമായി, സിംഗിൾ-ഫൈബർ വൈവിധ്യത്തെയും അട്രോഫിക് ഉത്തേജനങ്ങളോടും വാർദ്ധക്യത്തോടുമുള്ള അവയുടെ പ്രതികരണത്തെയും ചിത്രീകരിക്കുന്നതിൽ ഗണ്യമായ പുരോഗതി കൈവരിച്ചിട്ടുണ്ട്11,12,13,14,15,16,17,18. പ്രധാനമായും, ഈ സാങ്കേതിക പുരോഗതിക്ക് ക്ലിനിക്കൽ ആപ്ലിക്കേഷനുകളുണ്ട്, ഇത് രോഗവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ഡിസ്‌റെഗുലേഷന്റെ കൂടുതൽ വിശദവും കൃത്യവുമായ സ്വഭാവരൂപീകരണം അനുവദിക്കുന്നു. ഉദാഹരണത്തിന്, ഏറ്റവും സാധാരണമായ പാരമ്പര്യ പേശി രോഗങ്ങളിലൊന്നായ (MIM 605355 ഉം MIM 161800 ഉം) നെമാലിൻ മയോപ്പതിയുടെ പാത്തോഫിസിയോളജി സങ്കീർണ്ണവും ആശയക്കുഴപ്പമുണ്ടാക്കുന്നതുമാണ്. 19,20 അതിനാൽ, അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ ക്രമക്കേടിന്റെ മെച്ചപ്പെട്ട സ്വഭാവം ഈ രോഗത്തെക്കുറിച്ചുള്ള നമ്മുടെ ഗ്രാഹ്യത്തിൽ ഗണ്യമായ പുരോഗതിയിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാം.
മനുഷ്യ ബയോപ്സി മാതൃകകളിൽ നിന്ന് സ്വമേധയാ വേർതിരിച്ചെടുത്ത ഒറ്റ അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്, പ്രോട്ടിയോമിക് വിശകലനത്തിനുള്ള രീതികൾ ഞങ്ങൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു, ആയിരക്കണക്കിന് നാരുകളിൽ അവ പ്രയോഗിച്ചു, ഇത് മനുഷ്യ അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ സെല്ലുലാർ വൈവിധ്യത്തെക്കുറിച്ച് അന്വേഷിക്കാൻ ഞങ്ങളെ അനുവദിച്ചു. ഈ പഠനത്തിനിടയിൽ, പേശി നാരുകളുടെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്, പ്രോട്ടിയോമിക് ഫിനോടൈപ്പിംഗിന്റെ ശക്തി ഞങ്ങൾ പ്രകടമാക്കി, ഇന്റർഫൈബർ വേരിയബിളിറ്റിയുടെ പ്രധാന ഉറവിടങ്ങളായി മെറ്റബോളിക്, റൈബോസോമൽ, സെല്ലുലാർ ജംഗ്ഷണൽ പ്രോട്ടീനുകളെ തിരിച്ചറിഞ്ഞു. കൂടാതെ, ഈ പ്രോട്ടിയോമിക് വർക്ക്ഫ്ലോ ഉപയോഗിച്ച്, സിംഗിൾ അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളിൽ നെമറ്റോഡ് മയോപ്പതിയുടെ ക്ലിനിക്കൽ പ്രസക്തി ഞങ്ങൾ ചിത്രീകരിച്ചു, MYH അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഫൈബർ തരത്തിൽ നിന്ന് സ്വതന്ത്രമായി ഓക്സിഡേറ്റീവ് അല്ലാത്ത നാരുകളിലേക്കുള്ള ഏകോപിത മാറ്റം വെളിപ്പെടുത്തി.
മനുഷ്യ അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ വൈവിധ്യത്തെക്കുറിച്ച് അന്വേഷിക്കുന്നതിനായി, സിംഗിൾ സ്കെലിറ്റൽ പേശി നാരുകളുടെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോം, പ്രോട്ടിയോം വിശകലനം പ്രാപ്തമാക്കുന്നതിന് ഞങ്ങൾ രണ്ട് വർക്ക്ഫ്ലോകൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു (ചിത്രം 1A, അനുബന്ധ ചിത്രം 1A). സാമ്പിൾ സംഭരണം, ആർ‌എൻ‌എ, പ്രോട്ടീൻ സമഗ്രത എന്നിവയുടെ സംരക്ഷണം മുതൽ ഓരോ സമീപനത്തിനും ത്രൂപുട്ട് ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുന്നത് വരെയുള്ള നിരവധി രീതിശാസ്ത്ര ഘട്ടങ്ങൾ ഞങ്ങൾ വികസിപ്പിക്കുകയും ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോം വിശകലനത്തിനായി, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷന്റെ പ്രാരംഭ ഘട്ടത്തിൽ സാമ്പിൾ-നിർദ്ദിഷ്ട മോളിക്യുലാർ ബാർകോഡുകൾ ചേർത്താണ് ഇത് നേടിയത്, ഇത് കാര്യക്ഷമമായ ഡൌൺസ്ട്രീം പ്രോസസ്സിംഗിനായി 96 നാരുകൾ പൂൾ ചെയ്യാൻ അനുവദിച്ചു. പരമ്പരാഗത സിംഗിൾ-സെൽ സമീപനങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ആഴത്തിലുള്ള സീക്വൻസിംഗ് (±1 ദശലക്ഷം റീഡുകൾ ഒരു ഫൈബറിൽ) ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോം ഡാറ്റയെ കൂടുതൽ സമ്പന്നമാക്കി. 21 പ്രോട്ടിയോമിക്സിനായി, ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട് നിലനിർത്തിക്കൊണ്ട് പ്രോട്ടീം ഡെപ്ത് ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുന്നതിന് ഒരു ടിംസ്റ്റോഫ് മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്ററിൽ DIA-PASEF ഡാറ്റ ഏറ്റെടുക്കലുമായി സംയോജിപ്പിച്ച് ഒരു ചെറിയ ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫിക് ഗ്രേഡിയന്റ് (21 മിനിറ്റ്) ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു. 22,23 ആരോഗ്യമുള്ള അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ വൈവിധ്യത്തെക്കുറിച്ച് അന്വേഷിക്കുന്നതിന്, ആരോഗ്യമുള്ള 14 മുതിർന്ന ദാതാക്കളിൽ നിന്നുള്ള 1,050 വ്യക്തിഗത നാരുകളുടെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമുകളും 5 ആരോഗ്യമുള്ള മുതിർന്ന ദാതാക്കളിൽ നിന്നുള്ള 1,038 നാരുകളുടെ പ്രോട്ടിയോമുകളും ഞങ്ങൾ വേർതിരിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി പട്ടിക 1). ഈ പ്രബന്ധത്തിൽ, ഈ ഡാറ്റാസെറ്റുകളെ യഥാക്രമം 1,000-ഫൈബർ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമുകളും പ്രോട്ടിയോമുകളും എന്ന് വിളിക്കുന്നു. 1,000-ഫൈബർ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്, പ്രോട്ടിയോമിക് വിശകലനങ്ങളിൽ ആകെ 27,237 ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളും 2,983 പ്രോട്ടീനുകളും ഞങ്ങളുടെ സമീപനം കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 1A, സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റാസെറ്റുകൾ 1–2). കണ്ടെത്തിയ 1,000 ജീനുകൾക്കും ഓരോ ഫൈബറിനും 50% സാധുവായ മൂല്യങ്ങൾക്കുമായി ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്, പ്രോട്ടിയോമിക് ഡാറ്റാസെറ്റുകൾ ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത ശേഷം, ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിലെയും പ്രോട്ടിയോമിലെയും യഥാക്രമം 925 ഉം 974 ഉം നാരുകൾക്കായി തുടർന്നുള്ള ബയോഇൻഫോർമാറ്റിക്സ് വിശകലനങ്ങൾ നടത്തി. ഫിൽട്ടർ ചെയ്തതിനുശേഷം, ഓരോ ഫൈബറിലും ശരാശരി 4257 ± 1557 ജീനുകളും 2015 ± 234 പ്രോട്ടീനുകളും (ശരാശരി ± SD) കണ്ടെത്തി, പരിമിതമായ വ്യക്തിഗത വേരിയബിളിറ്റിയോടെ (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രങ്ങൾ 1B–C, സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റാസെറ്റുകൾ 3–4). എന്നിരുന്നാലും, വ്യത്യസ്ത നീളമുള്ള നാരുകളും ക്രോസ്-സെക്ഷണൽ ഏരിയകളും തമ്മിലുള്ള ആർ‌എൻ‌എ/പ്രോട്ടീൻ വിളവിലെ വ്യത്യാസങ്ങൾ കാരണം, പങ്കെടുക്കുന്നവരിൽ വിഷയത്തിനുള്ളിൽ വേരിയബിളിറ്റി കൂടുതൽ പ്രകടമായിരുന്നു. മിക്ക പ്രോട്ടീനുകൾക്കും (>2000), വേരിയേഷന്റെ ഗുണകം 20% ൽ താഴെയായിരുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1D). പേശികളുടെ സങ്കോചത്തിന് പ്രധാനപ്പെട്ട ഉയർന്ന പ്രകടനമുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളുടെയും പ്രോട്ടീനുകളുടെയും വിശാലമായ ഡൈനാമിക് ശ്രേണി പിടിച്ചെടുക്കാൻ രണ്ട് രീതികളും അനുവദിച്ചു (ഉദാ, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രങ്ങൾ 1E–F). തിരിച്ചറിഞ്ഞ സവിശേഷതകളിൽ ഭൂരിഭാഗവും ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്, പ്രോട്ടിയോമിക് ഡാറ്റാസെറ്റുകൾക്കിടയിൽ പൊതുവായിരുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1G), കൂടാതെ ഈ സവിശേഷതകളുടെ ശരാശരി UMI/LFQ തീവ്രതകൾ ന്യായമായും പരസ്പരം ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (r = 0.52) (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1H).
ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്സ്, പ്രോട്ടിയോമിക്സ് വർക്ക്ഫ്ലോ (BioRender.com ഉപയോഗിച്ച് സൃഷ്ടിച്ചത്). BD MYH7, MYH2, MYH1 എന്നിവയ്ക്കുള്ള ഡൈനാമിക് റേഞ്ച് കർവുകളും ഫൈബർ തരം അസൈൻമെന്റിനുള്ള കണക്കാക്കിയ പരിധികളും. E, F ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്സ്, പ്രോട്ടിയോമിക്സ് ഡാറ്റാസെറ്റുകളിലെ ഫൈബറുകളിലുടനീളം MYH എക്സ്പ്രഷന്റെ വിതരണം. G, H MYH-അധിഷ്ഠിത ഫൈബർ തരം അനുസരിച്ച് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്സ്, പ്രോട്ടിയോമിക്സ് എന്നിവയ്ക്കുള്ള യൂണിഫോം ഡൈവേഴ്സിറ്റി അപ്രോക്സിമേഷൻ ആൻഡ് പ്രൊജക്ഷൻ (UMAP) പ്ലോട്ടുകൾ. ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്സ്, പ്രോട്ടിയോമിക്സ് ഡാറ്റാസെറ്റുകളിൽ MYH7, MYH2, MYH1 എക്സ്പ്രഷൻ കാണിക്കുന്ന I, J ഫീച്ചർ പ്ലോട്ടുകൾ.
ഒമിക്സ് ഡാറ്റാസെറ്റുകളിലെ MYH എക്സ്പ്രഷന്റെ ഉയർന്ന സെൻസിറ്റിവിറ്റിയും ഡൈനാമിക് റേഞ്ചും പ്രയോജനപ്പെടുത്തുന്ന ഒരു ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത സമീപനം ഉപയോഗിച്ച് ഓരോ ഫൈബറിനും MYH-അധിഷ്ഠിത ഫൈബർ തരം നൽകാൻ ഞങ്ങൾ ആദ്യം തീരുമാനിച്ചു. മുൻ പഠനങ്ങൾ നാരുകളെ ശുദ്ധമായ ടൈപ്പ് 1, ടൈപ്പ് 2A, ടൈപ്പ് 2X, അല്ലെങ്കിൽ വ്യത്യസ്ത MYH-കളുടെ നിശ്ചിത ശതമാനം എക്സ്പ്രഷനെ അടിസ്ഥാനമാക്കി മിക്സഡ് എന്നിങ്ങനെ ലേബൽ ചെയ്യുന്നതിന് അനിയന്ത്രിതമായ പരിധികൾ ഉപയോഗിച്ചു. ഓരോ ഫൈബറിന്റെയും എക്സ്പ്രഷൻ യഥാക്രമം ടൈപ്പ് 1, ടൈപ്പ് 2A, ടൈപ്പ് 2X ഫൈബറുകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന MYH7, MYH2, MYH1 എന്നിവയാൽ റാങ്ക് ചെയ്യപ്പെട്ട ഒരു വ്യത്യസ്ത സമീപനമാണ് ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചത്. തുടർന്ന് ഞങ്ങൾ ഗണിതശാസ്ത്രപരമായി ഓരോ ഫലമായുണ്ടാകുന്ന വക്രത്തിന്റെയും താഴ്ന്ന ഇൻഫ്ലക്ഷൻ പോയിന്റ് കണക്കാക്കി, ഓരോ MYH-നും പോസിറ്റീവ് (ത്രെഷോൾഡിന് മുകളിൽ) അല്ലെങ്കിൽ നെഗറ്റീവ് (ത്രെഷോൾഡിന് താഴെ) ആയി നാരുകൾ നൽകുന്നതിന് ഒരു പരിധിയായി അത് ഉപയോഗിച്ചു (ചിത്രം 1B–D). പ്രോട്ടീൻ ലെവലുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ RNA ലെവലിൽ MYH7 (ചിത്രം 1B), MYH2 (ചിത്രം 1C) എന്നിവയ്ക്ക് കൂടുതൽ വ്യത്യസ്തമായ ഓൺ/ഓഫ് എക്സ്പ്രഷൻ പ്രൊഫൈലുകൾ ഉണ്ടെന്ന് ഈ ഡാറ്റ തെളിയിക്കുന്നു. തീർച്ചയായും, പ്രോട്ടീൻ ലെവലിൽ, വളരെ കുറച്ച് നാരുകൾ മാത്രമേ MYH7 പ്രകടിപ്പിക്കുന്നുള്ളൂ, കൂടാതെ ഒരു ഫൈബറിനും 100% MYH2 എക്സ്പ്രഷൻ ഇല്ലായിരുന്നു. അടുത്തതായി ഓരോ ഡാറ്റാസെറ്റിലെയും എല്ലാ നാരുകളിലേക്കും MYH-അധിഷ്ഠിത ഫൈബർ തരങ്ങൾ നിയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ മുൻകൂട്ടി നിശ്ചയിച്ച എക്സ്പ്രഷൻ പരിധികൾ ഉപയോഗിച്ചു. ഉദാഹരണത്തിന്, MYH7+/MYH2-/MYH1- നാരുകൾ ടൈപ്പ് 1 ലേക്ക് നിയോഗിക്കപ്പെട്ടു, അതേസമയം MYH7-/MYH2+/MYH1+ നാരുകൾ മിക്സഡ് ടൈപ്പ് 2A/2X ലേക്ക് നിയോഗിക്കപ്പെട്ടു (പൂർണ്ണ വിവരണത്തിനായി സപ്ലിമെന്ററി പട്ടിക 2 കാണുക). എല്ലാ നാരുകളും പൂൾ ചെയ്യുമ്പോൾ, RNA (ചിത്രം 1E) ലും പ്രോട്ടീൻ (ചിത്രം 1F) ലെവലിലും MYH-അധിഷ്ഠിത ഫൈബർ തരങ്ങളുടെ ശ്രദ്ധേയമായ സമാനമായ വിതരണം ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, അതേസമയം MYH-അധിഷ്ഠിത ഫൈബർ തരങ്ങളുടെ ആപേക്ഷിക ഘടന വ്യക്തികളിലുടനീളം വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 2A). മിക്ക നാരുകളും പ്യുവർ ടൈപ്പ് 1 (34–35%) അല്ലെങ്കിൽ ടൈപ്പ് 2A (36–38%) എന്നിങ്ങനെ തരംതിരിച്ചിട്ടുണ്ട്, എന്നിരുന്നാലും ഗണ്യമായ എണ്ണം മിക്സഡ് ടൈപ്പ് 2A/2X നാരുകളും കണ്ടെത്തി (16–19%). ശ്രദ്ധേയമായ ഒരു വ്യത്യാസം, പ്യുവർ ടൈപ്പ് 2X നാരുകൾ ആർഎൻഎ തലത്തിൽ മാത്രമേ കണ്ടെത്താൻ കഴിയൂ, പക്ഷേ പ്രോട്ടീൻ തലത്തിൽ കണ്ടെത്താൻ കഴിയില്ല എന്നതാണ്, ഇത് ദ്രുതഗതിയിലുള്ള MYH എക്സ്പ്രഷൻ കുറഞ്ഞത് ഭാഗികമായെങ്കിലും പോസ്റ്റ്-ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ വഴി നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ആന്റിബോഡി അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഡോട്ട് ബ്ലോട്ടിംഗ് ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങളുടെ പ്രോട്ടിയോമിക്സ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള MYH ഫൈബർ ടൈപ്പിംഗ് രീതി ഞങ്ങൾ സാധൂകരിച്ചു, കൂടാതെ ശുദ്ധമായ ടൈപ്പ് 1, ടൈപ്പ് 2A നാരുകൾ തിരിച്ചറിയുന്നതിൽ രണ്ട് രീതികളും 100% യോജിപ്പ് നേടി (അനുബന്ധ ചിത്രം 2B കാണുക). എന്നിരുന്നാലും, പ്രോട്ടിയോമിക്സ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള സമീപനം കൂടുതൽ സെൻസിറ്റീവ് ആയിരുന്നു, മിക്സഡ് ഫൈബറുകൾ തിരിച്ചറിയുന്നതിലും ഓരോ ഫൈബറിലും ഓരോ MYH ജീനിന്റെയും അനുപാതം അളക്കുന്നതിലും കൂടുതൽ കാര്യക്ഷമമായിരുന്നു. അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ തരങ്ങളെ ചിത്രീകരിക്കുന്നതിന് വസ്തുനിഷ്ഠവും ഉയർന്ന സെൻസിറ്റീവുമായ ഒമിക്സ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള സമീപനം ഉപയോഗിക്കുന്നതിന്റെ ഫലപ്രാപ്തി ഈ ഡാറ്റ പ്രകടമാക്കുന്നു.
ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്സും പ്രോട്ടിയോമിക്സും നൽകിയ സംയോജിത വിവരങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച്, മയോഫൈബറുകളെ അവയുടെ പൂർണ്ണമായ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോം അല്ലെങ്കിൽ പ്രോട്ടിയോം അടിസ്ഥാനമാക്കി വസ്തുനിഷ്ഠമായി തരംതിരിച്ചു. ആറ് പ്രധാന ഘടകങ്ങളിലേക്ക് ഡൈമൻഷണാലിറ്റി കുറയ്ക്കുന്നതിന് യൂണിഫോം മാനിഫോൾഡ് അപ്രോക്സിമേഷൻ ആൻഡ് പ്രൊജക്ഷൻ (UMAP) രീതി ഉപയോഗിച്ച് (സപ്ലിമെന്ററി ഫിഗേഴ്സ് 3A–B), ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിലും (ചിത്രം 1G) പ്രോട്ടിയോമിലും (ചിത്രം 1H) മയോഫൈബർ വേരിയബിളിറ്റി ദൃശ്യവൽക്കരിക്കാൻ ഞങ്ങൾക്ക് കഴിഞ്ഞു. ശ്രദ്ധേയമായി, ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്സ് അല്ലെങ്കിൽ പ്രോട്ടിയോമിക്സ് ഡാറ്റാസെറ്റുകളിൽ പങ്കാളികൾ (സപ്ലിമെന്ററി ഫിഗേഴ്സ് 3C–D) അല്ലെങ്കിൽ ടെസ്റ്റിംഗ് ദിവസങ്ങൾ (സപ്ലിമെന്ററി ഫിഗേഴ്സ് 3E) അനുസരിച്ച് മയോഫൈബറുകളെ ഗ്രൂപ്പുചെയ്തിട്ടില്ല, ഇത് അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളിലെ വിഷയത്തിനുള്ളിലെ വേരിയബിളിറ്റി വിഷയങ്ങൾക്കിടയിലുള്ള വേരിയബിളിറ്റിയേക്കാൾ കൂടുതലാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. UMAP പ്ലോട്ടിൽ, "വേഗതയേറിയ", "വേഗത കുറഞ്ഞ" മയോഫൈബറുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന രണ്ട് വ്യത്യസ്ത ക്ലസ്റ്ററുകൾ ഉയർന്നുവന്നു (ചിത്രങ്ങൾ 1G–H). MYH7+ (സ്ലോ) മയോഫൈബറുകൾ UMAP1 ന്റെ പോസിറ്റീവ് പോളിൽ ക്ലസ്റ്റർ ചെയ്‌തിരുന്നു, അതേസമയം MYH2+, MYH1+ (ഫാസ്റ്റ്) മയോഫൈബറുകൾ UMAP1 ന്റെ നെഗറ്റീവ് പോളിൽ ക്ലസ്റ്റർ ചെയ്‌തിരുന്നു (ചിത്രങ്ങൾ 1I–J). എന്നിരുന്നാലും, MYH എക്സ്പ്രഷനെ അടിസ്ഥാനമാക്കി ഫാസ്റ്റ്-ട്വിച്ച് ഫൈബർ തരങ്ങൾ (അതായത്, ടൈപ്പ് 2A, ടൈപ്പ് 2X, അല്ലെങ്കിൽ മിക്സഡ് 2A/2X) തമ്മിൽ ഒരു വ്യത്യാസവും വരുത്തിയിട്ടില്ല, ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് MYH1 (ചിത്രം 1I–J) അല്ലെങ്കിൽ ACTN3 അല്ലെങ്കിൽ MYLK2 പോലുള്ള മറ്റ് ക്ലാസിക്കൽ 2X മയോഫൈബർ മാർക്കറുകൾ (സപ്ലിമെന്ററി ഫിഗറുകൾ 4A–B) എക്സ്പ്രഷൻ മുഴുവൻ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമോ പ്രോട്ടീമോ പരിഗണിക്കുമ്പോൾ വ്യത്യസ്ത മയോഫൈബർ തരങ്ങൾക്കിടയിൽ വ്യത്യാസമില്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. മാത്രമല്ല, MYH2, MYH7 എന്നിവയുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, കുറച്ച് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളോ പ്രോട്ടീനുകളോ MYH1 മായി പോസിറ്റീവ് ആയി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ഫിഗ്സ്. 4C–H), ഇത് MYH1 സമൃദ്ധി മയോഫൈബർ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോം/പ്രോട്ടീമിനെ പൂർണ്ണമായി പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നില്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. UMAP തലത്തിൽ മൂന്ന് MYH ഐസോഫോമുകളുടെ മിക്സഡ് എക്സ്പ്രഷൻ വിലയിരുത്തിയപ്പോൾ സമാനമായ നിഗമനങ്ങളിൽ എത്തി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 4I–J). അങ്ങനെ, MYH ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷനെ മാത്രം അടിസ്ഥാനമാക്കി ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് തലത്തിൽ 2X നാരുകൾ തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയുമെങ്കിലും, മുഴുവൻ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമോ പ്രോട്ടിയോമോ പരിഗണിക്കുമ്പോൾ MYH1+ നാരുകൾ മറ്റ് ഫാസ്റ്റ് ഫൈബറുകളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചറിയാൻ കഴിയില്ല.
MYH നുമപ്പുറമുള്ള സ്ലോ ഫൈബർ വൈവിധ്യത്തിന്റെ പ്രാരംഭ പര്യവേക്ഷണമെന്ന നിലയിൽ, നാല് സ്ഥാപിത സ്ലോ ഫൈബർ തരം-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രോട്ടീനുകളെ ഞങ്ങൾ വിലയിരുത്തി: TPM3, TNNT1, MYL3, ATP2A22. ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്സിലും (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 5A) പ്രോട്ടിയോമിക്സിലും (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 5B) MYH7 യുമായുള്ള പിയേഴ്സൺ പരസ്പരബന്ധം ഉയർന്നതാണെങ്കിലും, സ്ലോ ഫൈബർ ഉപവിഭാഗങ്ങൾ കാണിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 5C) പ്രോട്ടിയോമിക്സിലും (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 5D) എല്ലാ ജീൻ/പ്രോട്ടീൻ ഉപവിഭാഗങ്ങളും യഥാക്രമം സ്ലോ ഫൈബറുകളിൽ ഏകദേശം 25% ഉം 33% ഉം ശുദ്ധമായ സ്ലോ ഫൈബറുകളായി തരംതിരിച്ചിട്ടില്ല. അതിനാൽ, ഒന്നിലധികം ജീൻ/പ്രോട്ടീൻ ഉപവിഭാഗങ്ങളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള സ്ലോ ഫൈബർ വർഗ്ഗീകരണം, ഫൈബർ തരം-നിർദ്ദിഷ്ടമെന്ന് അറിയപ്പെടുന്ന പ്രോട്ടീനുകൾക്ക് പോലും അധിക സങ്കീർണ്ണത അവതരിപ്പിക്കുന്നു. ഒരൊറ്റ ജീൻ/പ്രോട്ടീൻ കുടുംബത്തിന്റെ ഐസോഫോമുകളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഫൈബർ വർഗ്ഗീകരണം അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ യഥാർത്ഥ വൈവിധ്യത്തെ വേണ്ടത്ര പ്രതിഫലിപ്പിച്ചേക്കില്ലെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
മുഴുവൻ ഒമിക്സ് മോഡലിന്റെ സ്കെയിലിൽ മനുഷ്യന്റെ അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ ഫിനോടൈപ്പിക് വേരിയബിളിറ്റി കൂടുതൽ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യുന്നതിന്, പ്രിൻസിപ്പൽ കമ്പോണന്റ് അനാലിസിസ് (പിസിഎ) (ചിത്രം 2എ) ഉപയോഗിച്ച് ഡാറ്റയുടെ നിഷ്പക്ഷമായ ഡൈമൻഷണാലിറ്റി റിഡക്ഷൻ ഞങ്ങൾ നടത്തി. യുഎംഎപി പ്ലോട്ടുകൾക്ക് സമാനമായി, പങ്കെടുക്കുന്നയാളോ പരീക്ഷണ ദിനമോ പിസിഎ തലത്തിൽ ഫൈബർ ക്ലസ്റ്ററിംഗിനെ സ്വാധീനിച്ചില്ല (സപ്ലിമെന്ററി ഫിഗറുകൾ 6എ–സി). രണ്ട് ഡാറ്റാസെറ്റുകളിലും, MYH-അധിഷ്ഠിത ഫൈബർ തരം PC2 വിശദീകരിച്ചു, ഇത് സ്ലോ-ട്വിച്ച് ടൈപ്പ് 1 ഫൈബറുകളുടെ ഒരു ക്ലസ്റ്ററും ഫാസ്റ്റ്-ട്വിച്ച് ടൈപ്പ് 2എ, ടൈപ്പ് 2എക്സ്, മിക്സഡ് 2എ/2എ ഫൈബറുകൾ എന്നിവ അടങ്ങിയ രണ്ടാമത്തെ ക്ലസ്റ്ററും കാണിച്ചു (ചിത്രം 2എ). രണ്ട് ഡാറ്റാസെറ്റുകളിലും, ഈ രണ്ട് ക്ലസ്റ്ററുകളും ചെറിയ എണ്ണം മിക്സഡ് ടൈപ്പ് 1/2എ ഫൈബറുകളാൽ ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, പ്രധാന പിസി ഡ്രൈവറുകളുടെ അമിത പ്രാതിനിധ്യ വിശകലനം പിസി 2 കോൺട്രാക്റ്റൈൽ, മെറ്റബോളിക് സിഗ്നേച്ചറുകളാൽ നയിക്കപ്പെടുന്നുവെന്ന് സ്ഥിരീകരിച്ചു (ചിത്രം 2ബി, സപ്ലിമെന്ററി ഫിഗറുകൾ 6ഡി–ഇ, സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റാസെറ്റുകൾ 5–6). മൊത്തത്തിൽ, MYH-അധിഷ്ഠിത ഫൈബർ തരം PC2-ൽ തുടർച്ചയായ വ്യതിയാനം വിശദീകരിക്കാൻ പര്യാപ്തമാണെന്ന് കണ്ടെത്തി, ഫാസ്റ്റ് ക്ലസ്റ്ററിനുള്ളിൽ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിലുടനീളം വിതരണം ചെയ്യപ്പെട്ട 2X ഫൈബറുകൾ എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്നവ ഒഴികെ.
എ. MYH അടിസ്ഥാനമാക്കി ഫൈബർ തരം അനുസരിച്ച് നിറമുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിന്റെയും പ്രോട്ടീം ഡാറ്റാസെറ്റുകളുടെയും പ്രിൻസിപ്പൽ കമ്പോണന്റ് അനാലിസിസ് (PCA) പ്ലോട്ടുകൾ. B. PC2, PC1 എന്നിവയിലെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റിന്റെയും പ്രോട്ടീൻ ഡ്രൈവറുകളുടെയും സമ്പുഷ്ടീകരണ വിശകലനം. ക്ലസ്റ്റർപ്രൊഫൈലർ പാക്കേജും ബെഞ്ചമിനി-ഹോച്ച്ബർഗ് ക്രമീകരിച്ച p-മൂല്യങ്ങളും ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനം നടത്തി. C, D. ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിലെ ഇന്റർസെല്ലുലാർ അഡീഷൻ ജീൻ ഓൺടോളജി (GO) പദങ്ങൾക്കനുസൃതമായി നിറമുള്ള PCA പ്ലോട്ടുകൾ, പ്രോട്ടിയോമിലെ കോസ്റ്റമേർ GO പദങ്ങൾ. അമ്പടയാളങ്ങൾ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ്, പ്രോട്ടീൻ ഡ്രൈവറുകളെയും അവയുടെ ദിശകളെയും പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. E, F. സ്ലോ/ഫാസ്റ്റ് ഫൈബർ തരത്തിൽ നിന്ന് സ്വതന്ത്രമായ എക്സ്പ്രഷൻ ഗ്രേഡിയന്റുകൾ കാണിക്കുന്ന ക്ലിനിക്കലി പ്രസക്തമായ സവിശേഷതകളുടെ പ്ലോട്ടുകൾ യൂണിഫോം മാനിഫോൾഡ് അപ്രോസിഷനും പ്രൊജക്ഷനും (UMAP) ഫീച്ചർ ചെയ്യുന്നു. G, H. ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമുകളിലും പ്രോട്ടിയോമുകളിലും PC2, PC1 ഡ്രൈവറുകൾ തമ്മിലുള്ള പരസ്പരബന്ധങ്ങൾ.
അപ്രതീക്ഷിതമായി, MYH-അധിഷ്ഠിത മയോഫൈബർ തരം രണ്ടാമത്തെ ഉയർന്ന ഡിഗ്രി വേരിയബിലിറ്റി (PC2) മാത്രമേ വിശദീകരിച്ചിട്ടുള്ളൂ, ഇത് MYH-അധിഷ്ഠിത മയോഫൈബർ തരവുമായി (PC1) ബന്ധമില്ലാത്ത മറ്റ് ജൈവ ഘടകങ്ങൾ സ്കെലിറ്റൽ പേശി നാരുകളുടെ വൈവിധ്യത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിൽ ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നുണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. PC1-ലെ മുൻനിര ഡ്രൈവറുകളുടെ അമിത പ്രാതിനിധ്യ വിശകലനം, PC1-ലെ വേരിയബിളിറ്റി പ്രാഥമികമായി നിർണ്ണയിക്കുന്നത് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിലെ സെൽ-സെൽ അഡീഷനും റൈബോസോം ഉള്ളടക്കവും, പ്രോട്ടിയോമിലെ കോസ്റ്റാമിയറുകളും റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീനുകളുമാണ് എന്ന് വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം 2B, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രങ്ങൾ 6D–E, സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ സെറ്റ് 7). സ്കെലിറ്റൽ പേശികളിൽ, കോസ്റ്റാമിയർ Z-ഡിസ്കിനെ സാർകോലെമ്മയുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുകയും ബലപ്രയോഗത്തിലും സിഗ്നലിംഗിലും ഏർപ്പെടുകയും ചെയ്യുന്നു. 25 സെൽ-സെൽ അഡീഷൻ (ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോം, ചിത്രം 2C), കോസ്റ്റാമിയർ (പ്രോട്ടോം, ചിത്രം 2D) സവിശേഷതകൾ ഉപയോഗിച്ച് വ്യാഖ്യാനിച്ച PCA പ്ലോട്ടുകൾ PC1-ൽ ശക്തമായ ഇടത് മാറ്റം വെളിപ്പെടുത്തി, ഈ സവിശേഷതകൾ ചില നാരുകളിൽ സമ്പുഷ്ടമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
UMAP തലത്തിൽ മയോഫൈബർ ക്ലസ്റ്ററിംഗിന്റെ കൂടുതൽ വിശദമായ പരിശോധനയിൽ, മിക്ക സവിശേഷതകളും മയോഫൈബർ സബ്ക്ലസ്റ്റർ-നിർദ്ദിഷ്ടമല്ല, മറിച്ച് മയോഫൈബർ തരം-സ്വതന്ത്ര MYH-അധിഷ്ഠിത എക്സ്പ്രഷൻ ഗ്രേഡിയന്റ് പ്രദർശിപ്പിച്ചതായി കണ്ടെത്തി. CHCHD10 (ന്യൂറോമസ്കുലാർ രോഗം), SLIT3 (പേശി ക്ഷയം), CTDNEP1 (പേശി രോഗം) പോലുള്ള പാത്തോളജിക്കൽ അവസ്ഥകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട നിരവധി ജീനുകൾക്ക് ഈ തുടർച്ച നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു. ന്യൂറോളജിക്കൽ ഡിസോർഡേഴ്സ് (UGDH), ഇൻസുലിൻ സിഗ്നലിംഗ് (PHIP), ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ (HIST1H2AB) എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പ്രോട്ടീനുകൾ ഉൾപ്പെടെ പ്രോട്ടീനിലുടനീളം ഈ തുടർച്ച നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (ചിത്രം 2F). മൊത്തത്തിൽ, വ്യത്യസ്ത മയോഫൈബറുകളിലുടനീളം ഫൈബർ തരം-സ്വതന്ത്ര സ്ലോ/ഫാസ്റ്റ് ട്വിച്ച് വൈവിധ്യത്തിൽ തുടർച്ചയെ ഈ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, PC2 ലെ ഡ്രൈവർ ജീനുകൾ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോം-പ്രോട്ടോം പരസ്പരബന്ധം (r = 0.663) കാണിച്ചു (ചിത്രം 2G), ഇത് സ്ലോ-ഫാസ്റ്റ്-ട്വിച്ച് ഫൈബർ തരങ്ങൾ, പ്രത്യേകിച്ച് അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ സങ്കോചപരവും ഉപാപചയപരവുമായ ഗുണങ്ങൾ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനിലൂടെ നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, PC1 ലെ ഡ്രൈവർ ജീനുകൾ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോം-പ്രോട്ടോം പരസ്പരബന്ധം കാണിച്ചില്ല (r = -0.027) (ചിത്രം 2H), സ്ലോ/ഫാസ്റ്റ്-ട്വിച്ച് ഫൈബർ തരങ്ങളുമായി ബന്ധമില്ലാത്ത വ്യതിയാനങ്ങൾ പ്രധാനമായും പോസ്റ്റ്-ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനിലൂടെ നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്നു എന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. PC1 ലെ വ്യതിയാനങ്ങൾ പ്രധാനമായും റൈബോസോമൽ ജീൻ ഒന്റോളജി പദങ്ങളാൽ വിശദീകരിക്കപ്പെട്ടതിനാലും, പ്രോട്ടീൻ വിവർത്തനത്തിൽ സജീവമായി പങ്കെടുക്കുന്നതിലൂടെയും സ്വാധീനിക്കുന്നതിലൂടെയും റൈബോസോമുകൾ കോശത്തിൽ നിർണായകവും പ്രത്യേകവുമായ പങ്ക് വഹിക്കുന്നതിനാലും, 31 അടുത്തതായി ഈ അപ്രതീക്ഷിത റൈബോസോമൽ വൈവിധ്യത്തെക്കുറിച്ച് അന്വേഷിക്കാൻ ഞങ്ങൾ പുറപ്പെട്ടു.
GOCC പദമായ "സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് റൈബോസോം" (ചിത്രം 3A) ലെ പ്രോട്ടീനുകളുടെ ആപേക്ഷിക സമൃദ്ധി അനുസരിച്ച് ഞങ്ങൾ ആദ്യം പ്രോട്ടിയോമിക്സ് പ്രിൻസിപ്പൽ കമ്പോണന്റ് വിശകലന പ്ലോട്ട് കളർ ചെയ്തു. ഈ പദം PC1 ന്റെ പോസിറ്റീവ് വശത്ത് സമ്പുഷ്ടമാക്കിയിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, ഒരു ചെറിയ ഗ്രേഡിയന്റ് ഉണ്ടാകുന്നുണ്ടെങ്കിലും, റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീനുകൾ PC1 ന്റെ രണ്ട് ദിശകളിലേക്കും വിഭജനം നയിക്കുന്നു (ചിത്രം 3A). PC1 ന്റെ നെഗറ്റീവ് വശത്ത് സമ്പുഷ്ടമാക്കിയ റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീനുകളിൽ RPL18, RPS18, RPS13 (ചിത്രം 3B) എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു, അതേസമയം RPL31, RPL35, RPL38 (ചിത്രം 3C) എന്നിവ PC1 ന്റെ പോസിറ്റീവ് വശത്തെ പ്രധാന ഡ്രൈവറുകളായിരുന്നു. രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, മറ്റ് ടിഷ്യൂകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ അസ്ഥികൂട പേശികളിൽ RPL38 ഉം RPS13 ഉം വളരെ പ്രകടമായിരുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 7A). PC1 ലെ ഈ വ്യതിരിക്തമായ റൈബോസോമൽ ഒപ്പുകൾ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടില്ല (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 7B), ഇത് പോസ്റ്റ്-ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ റെഗുലേഷനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
A. പ്രോട്ടിയോമിലുടനീളം സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് റൈബോസോമൽ ജീൻ ഓൺടോളജി (GO) പദങ്ങൾ അനുസരിച്ച് പ്രിൻസിപ്പൽ കമ്പോണന്റ് അനാലിസിസ് (PCA) പ്ലോട്ട് നിറം നൽകിയിരിക്കുന്നു. PCA പ്ലോട്ടിലെ പ്രോട്ടീൻ-മധ്യസ്ഥ വ്യതിയാനത്തിന്റെ ദിശയെ അമ്പടയാളങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ലൈൻ നീളം നൽകിയിരിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനിനുള്ള പ്രിൻസിപ്പൽ കമ്പോണന്റ് സ്കോറുമായി യോജിക്കുന്നു. B, C. RPS13, RPL38 എന്നിവയ്ക്കുള്ള PCA ഫീച്ചർ പ്ലോട്ടുകൾ. D. സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീനുകളുടെ മേൽനോട്ടമില്ലാത്ത ഹൈറാർക്കിക്കൽ ക്ലസ്റ്ററിംഗ് വിശകലനം. E. അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളിൽ വ്യത്യസ്ത സമൃദ്ധിയുള്ള റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീനുകളെ എടുത്തുകാണിക്കുന്ന 80S റൈബോസോമിന്റെ (PDB: 4V6X) ഘടനാപരമായ മാതൃക. F. mRNA എക്സിറ്റ് ചാനലിന് സമീപം പ്രാദേശികവൽക്കരിച്ച വ്യത്യസ്ത സ്റ്റോയിക്കിയോമെട്രി ഉള്ള റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീനുകൾ.
റൈബോസോമൽ വൈവിധ്യത്തിന്റെയും സ്പെഷ്യലൈസേഷന്റെയും ആശയങ്ങൾ മുമ്പ് നിർദ്ദേശിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്, അതുവഴി വ്യത്യസ്ത ടിഷ്യൂകളിലും കോശങ്ങളിലും 33 പ്രോട്ടീൻ വിവർത്തനത്തെ നേരിട്ട് സ്വാധീനിക്കാൻ കഴിയുന്ന വ്യത്യസ്ത റൈബോസോമൽ വൈവിധ്യത്തിന്റെ (റൈബോസോമൽ വൈവിധ്യത്തിന്റെ) സാന്നിധ്യം നിർദ്ദിഷ്ട mRNA ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് പൂളുകളുടെ സെലക്ടീവ് വിവർത്തനത്തിലൂടെ (റൈബോസോമൽ സ്പെഷ്യലൈസേഷൻ) നേരിട്ട് സ്വാധീനിക്കും. അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളിൽ സഹ-പ്രകടിപ്പിച്ച റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഉപജനസംഖ്യയെ തിരിച്ചറിയാൻ, പ്രോട്ടിയോമിലെ റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഒരു മേൽനോട്ടമില്ലാത്ത ശ്രേണിപരമായ ക്ലസ്റ്ററിംഗ് വിശകലനം ഞങ്ങൾ നടത്തി (ചിത്രം 3D, സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ സെറ്റ് 8). പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, MYH അടിസ്ഥാനമാക്കി ഫൈബർ തരം അനുസരിച്ച് റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീനുകൾ ക്ലസ്റ്റർ ചെയ്തില്ല. എന്നിരുന്നാലും, റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീനുകളുടെ മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത ക്ലസ്റ്ററുകൾ ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു; ആദ്യത്തെ ക്ലസ്റ്റർ (റൈബോസോമൽ_ക്ലസ്റ്റർ_1) RPL38 ഉപയോഗിച്ച് സഹ-നിയന്ത്രിതമാണ്, അതിനാൽ പോസിറ്റീവ് PC1 പ്രൊഫൈലുള്ള നാരുകളിൽ എക്സ്പ്രഷൻ വർദ്ധിച്ചിട്ടുണ്ട്. രണ്ടാമത്തെ ക്ലസ്റ്റർ (റൈബോസോമൽ_ക്ലസ്റ്റർ_2) RPS13 ഉപയോഗിച്ച് സഹ-നിയന്ത്രിതമാണ്, കൂടാതെ നെഗറ്റീവ് PC1 പ്രൊഫൈലുള്ള നാരുകളിൽ ഉയർത്തിയിരിക്കുന്നു. മൂന്നാമത്തെ ക്ലസ്റ്റർ (റൈബോസോമൽ_ക്ലസ്റ്റർ_3) സ്കെലിറ്റൽ പേശി നാരുകളിൽ ഏകോപിതമായ ഡിഫറൻഷ്യൽ എക്സ്പ്രഷൻ കാണിക്കുന്നില്ല, കൂടാതെ ഇതിനെ "കോർ" സ്കെലിറ്റൽ പേശി റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീൻ ആയി കണക്കാക്കാം. റൈബോസോമൽ ക്ലസ്റ്ററുകൾ 1 ഉം 2 ഉം റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീനുകൾ ഉൾക്കൊള്ളുന്നു, അവ മുമ്പ് ഇതര വിവർത്തനത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്നതായി കാണിച്ചിട്ടുണ്ട് (ഉദാ. RPL10A, RPL38, RPS19, RPS25) കൂടാതെ വികസനത്തെ പ്രവർത്തനപരമായി സ്വാധീനിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു (ഉദാ. RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 PCA ഫലങ്ങൾക്ക് അനുസൃതമായി, നാരുകളിലുടനീളം ഈ റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീനുകളുടെ നിരീക്ഷിച്ച വൈവിധ്യമാർന്ന പ്രാതിനിധ്യവും തുടർച്ച കാണിച്ചു (അനുബന്ധ ചിത്രം 7C).
റൈബോസോമിനുള്ളിലെ വൈവിധ്യമാർന്ന റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീനുകളുടെ സ്ഥാനം ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ മനുഷ്യ 80S റൈബോസോമിന്റെ ഒരു ഘടനാ മാതൃക ഉപയോഗിച്ചു (പ്രോട്ടീൻ ഡാറ്റ ബാങ്ക്: 4V6X) (ചിത്രം 3E). വ്യത്യസ്ത റൈബോസോമൽ ക്ലസ്റ്ററുകളിൽ നിന്നുള്ള റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീനുകളെ വേർതിരിച്ചതിനുശേഷം, അവയുടെ സ്ഥാനങ്ങൾ അടുത്ത് വിന്യസിച്ചിട്ടില്ല, ഇത് റൈബോസോമിന്റെ ചില പ്രദേശങ്ങൾ/ഭിന്നങ്ങൾ എന്നിവയ്ക്ക് സമ്പുഷ്ടീകരണം നൽകുന്നതിൽ ഞങ്ങളുടെ സമീപനം പരാജയപ്പെട്ടുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, ക്ലസ്റ്റർ 2 ലെ വലിയ ഉപയൂണിറ്റ് പ്രോട്ടീനുകളുടെ അനുപാതം ക്ലസ്റ്ററുകൾ 1, 3 എന്നിവയേക്കാൾ കുറവായിരുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 7D). അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളിൽ മാറ്റം വരുത്തിയ സ്റ്റോയിക്കിയോമെട്രി ഉള്ള പ്രോട്ടീനുകൾ പ്രധാനമായും റൈബോസോം ഉപരിതലത്തിലേക്ക് പ്രാദേശികവൽക്കരിക്കപ്പെട്ടിരിക്കുന്നതായി ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം 3E), വ്യത്യസ്ത mRNA പോപ്പുലേഷനുകളിലെ ആന്തരിക റൈബോസോം എൻട്രി സൈറ്റ് (IRES) ഘടകങ്ങളുമായി ഇടപഴകാനുള്ള അവയുടെ കഴിവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, അതുവഴി തിരഞ്ഞെടുത്ത വിവർത്തനം ഏകോപിപ്പിക്കുന്നു. 40, 41 കൂടാതെ, അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളിൽ മാറ്റം വരുത്തിയ സ്റ്റോയിക്കിയോമെട്രി ഉള്ള നിരവധി പ്രോട്ടീനുകൾ mRNA എക്സിറ്റ് ടണൽ (ചിത്രം 3F) പോലുള്ള പ്രവർത്തന മേഖലകൾക്ക് സമീപമാണ് സ്ഥിതി ചെയ്യുന്നത്, ഇത് വിവർത്തന നീളവും നിർദ്ദിഷ്ട പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ അറസ്റ്റും തിരഞ്ഞെടുത്ത് നിയന്ത്രിക്കുന്നു. 42 ചുരുക്കത്തിൽ, അസ്ഥികൂട പേശി റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീനുകളുടെ സ്റ്റോയിക്കിയോമെട്രി വൈവിധ്യം പ്രകടിപ്പിക്കുന്നുവെന്നും, ഇത് അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകൾക്കിടയിൽ വ്യത്യാസങ്ങൾക്ക് കാരണമാകുമെന്നും ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
അടുത്തതായി ഞങ്ങൾ വേഗതയേറിയതും വേഗത കുറഞ്ഞതുമായ ഫൈബർ സിഗ്നേച്ചറുകൾ തിരിച്ചറിയാനും അവയുടെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ നിയന്ത്രണത്തിന്റെ സംവിധാനങ്ങൾ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യാനും പുറപ്പെട്ടു. രണ്ട് ഡാറ്റാസെറ്റുകളിൽ (ചിത്രങ്ങൾ 1G–H ഉം 4A–B ഉം) UMAP നിർവചിച്ചിരിക്കുന്ന വേഗതയേറിയതും വേഗത കുറഞ്ഞതുമായ ഫൈബർ ക്ലസ്റ്ററുകളെ താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ, ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്, പ്രോട്ടിയോമിക് വിശകലനങ്ങൾ യഥാക്രമം 1366 ഉം 804 ഉം വ്യത്യസ്തമായി സമൃദ്ധമായ സവിശേഷതകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു (ചിത്രങ്ങൾ 4A–B, സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റാസെറ്റുകൾ 9–12). സാർകോമെറുകൾ (ഉദാ: ട്രോപോമിയോസിൻ, ട്രോപോണിൻ), എക്സിറ്റേഷൻ-സങ്കോച കപ്ലിംഗ് (SERCA ഐസോഫോമുകൾ), ഊർജ്ജ ഉപാപചയം (ഉദാ: ALDOA, CKB) എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട സിഗ്നേച്ചറുകളിൽ പ്രതീക്ഷിക്കുന്ന വ്യത്യാസങ്ങൾ ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു. മാത്രമല്ല, പ്രോട്ടീൻ യൂബിക്വിറ്റിനേഷനെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളും പ്രോട്ടീനുകളും വേഗതയേറിയതും വേഗത കുറഞ്ഞതുമായ ഫൈബറുകളിൽ വ്യത്യസ്തമായി പ്രകടിപ്പിച്ചു (ഉദാ: USP54, SH3RF2, USP28, USP48) (ചിത്രങ്ങൾ 4A–B). കൂടാതെ, മുമ്പ് ലാംബ് മസിൽ ഫൈബർ തരങ്ങളിൽ വ്യത്യസ്തമായി പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെടുന്നതും ഹൃദയ പേശികളിൽ SERCA പ്രവർത്തനം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതുമായ RP11-451G4.2 (DWORF) എന്ന മൈക്രോബയൽ പ്രോട്ടീൻ ജീൻ RP11-451G4.2 (DWORF) മന്ദഗതിയിലുള്ള അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളിൽ ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു (ചിത്രം 4A). അതുപോലെ, വ്യക്തിഗത ഫൈബർ തലത്തിൽ, മെറ്റബോളിസവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ലാക്റ്റേറ്റ് ഡീഹൈഡ്രജനേസ് ഐസോഫോമുകൾ (LDHA, LDHB, ചിത്രം 4C, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8A) 45,46 പോലുള്ള അറിയപ്പെടുന്ന സിഗ്നേച്ചറുകളിലും മുമ്പ് അറിയപ്പെടാത്ത ഫൈബർ-ടൈപ്പ്-നിർദ്ദിഷ്ട സിഗ്നേച്ചറുകളിലും (IRX3, USP54, USP28, DPYSL3 പോലുള്ളവ) (ചിത്രം 4C) കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു. ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്, പ്രോട്ടിയോമിക് ഡാറ്റാസെറ്റുകൾക്കിടയിൽ വ്യത്യസ്തമായി പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെട്ട സവിശേഷതകളുടെ ഒരു പ്രധാന ഓവർലാപ്പ് ഉണ്ടായിരുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8B), അതുപോലെ തന്നെ സാർകോമെയർ സവിശേഷതകളുടെ കൂടുതൽ വ്യക്തമായ ഡിഫറൻഷ്യൽ എക്സ്പ്രഷനാൽ നയിക്കപ്പെടുന്ന ഒരു മടക്ക മാറ്റ പരസ്പര ബന്ധവും (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8C). ശ്രദ്ധേയമായി, ചില ഒപ്പുകൾ (ഉദാ: USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) പ്രോട്ടിയോമിക് തലത്തിൽ മാത്രം ശക്തമായ പോസ്റ്റ്-ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ നിയന്ത്രണം കാണിച്ചു, കൂടാതെ സ്ലോ/ഫാസ്റ്റ് ട്വിച്ച് ഫൈബർ ടൈപ്പ്-നിർദ്ദിഷ്ട എക്സ്പ്രഷൻ പ്രൊഫൈലുകളും ഉണ്ടായിരുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8C).
ചിത്രം 1G–H-ലെ യൂണിഫോം മാനിഫോൾഡ് ഏകദേശവും പ്രൊജക്ഷൻ (UMAP) പ്ലോട്ടുകളും ഉപയോഗിച്ച് തിരിച്ചറിഞ്ഞ മന്ദഗതിയിലുള്ളതും വേഗതയേറിയതുമായ ക്ലസ്റ്ററുകളെ താരതമ്യം ചെയ്യുന്ന A, B അഗ്നിപർവ്വത പ്ലോട്ടുകൾ. FDR < 0.05-ൽ ഗണ്യമായി വ്യത്യസ്തമായ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളെയോ പ്രോട്ടീനുകളെയോ ഇരുണ്ട ഡോട്ടുകൾ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, ലോഗ് ചേഞ്ച് > 1-ൽ ഗണ്യമായി വ്യത്യസ്തമായ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളെയോ പ്രോട്ടീനുകളെയോ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. ബെഞ്ചമാനി-ഹോച്ച്ബർഗ് ക്രമീകരിച്ച പി മൂല്യങ്ങൾ (ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്സ്) ഉപയോഗിച്ചുള്ള DESeq2 വാൾഡ് ടെസ്റ്റ് അല്ലെങ്കിൽ ഒന്നിലധികം താരതമ്യങ്ങൾക്കായി (പ്രോട്ടോമിക്സ്) ബെഞ്ചമാനി-ഹോച്ച്ബർഗ് ക്രമീകരണം ഉപയോഗിച്ച് അനുഭവപരമായ ബയേസിയൻ വിശകലനത്തോടുകൂടിയ ലിംമ ലീനിയർ മോഡൽ രീതി ഉപയോഗിച്ച് ടു-വേ സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനം നടത്തി. C സ്ലോ, ഫാസ്റ്റ് നാരുകൾക്കിടയിലുള്ള തിരഞ്ഞെടുത്ത ഡിഫറൻഷ്യലി എക്സ്പ്രസ് ചെയ്ത ജീനുകളുടെയോ പ്രോട്ടീനുകളുടെയോ സിഗ്നേച്ചർ പ്ലോട്ടുകൾ. D ഗണ്യമായി വ്യത്യസ്തമായി പ്രകടിപ്പിച്ച ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളുടെയും പ്രോട്ടീനുകളുടെയും സമ്പുഷ്ടീകരണ വിശകലനം. ഓവർലാപ്പിംഗ് മൂല്യങ്ങൾ രണ്ട് ഡാറ്റാസെറ്റുകളിലും സമ്പുഷ്ടമാണ്, ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോം മൂല്യങ്ങൾ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിൽ മാത്രമേ സമ്പുഷ്ടമാകൂ, പ്രോട്ടിയോം മൂല്യങ്ങൾ പ്രോട്ടോമിൽ മാത്രമേ സമ്പുഷ്ടമാകൂ. ബെഞ്ചമാനി-ഹോച്ച്ബർഗ് ക്രമീകരിച്ച പി-മൂല്യങ്ങളുള്ള ക്ലസ്റ്റർപ്രൊഫൈലർ പാക്കേജ് ഉപയോഗിച്ചാണ് സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനം നടത്തിയത്. E. SCENIC-ൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ റെഗുലേറ്റർ സ്പെസിഫിസിറ്റി സ്കോറുകളും ഫൈബർ തരങ്ങൾക്കിടയിലുള്ള ഡിഫറൻഷ്യൽ mRNA എക്സ്പ്രഷനും അടിസ്ഥാനമാക്കി SCENIC തിരിച്ചറിഞ്ഞ ഫൈബർ തരം-നിർദ്ദിഷ്ട ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങൾ. F. വേഗത കുറഞ്ഞതും വേഗതയുള്ളതുമായ നാരുകൾക്കിടയിൽ വ്യത്യസ്തമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന തിരഞ്ഞെടുത്ത ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളുടെ പ്രൊഫൈലിംഗ്.
വ്യത്യസ്തമായി പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന ജീനുകളുടെയും പ്രോട്ടീനുകളുടെയും ഒരു ഓവർ-പ്രെസെൻറേഷൻ വിശകലനം ഞങ്ങൾ നടത്തി (ചിത്രം 4D, സപ്ലിമെന്റൽ ഡാറ്റ സെറ്റ് 13). രണ്ട് ഡാറ്റാസെറ്റുകൾക്കിടയിൽ വ്യത്യാസമുള്ള സവിശേഷതകൾക്കായുള്ള പാത്ത്‌വേ സമ്പുഷ്ടീകരണം, ഫാറ്റി ആസിഡ് β-ഓക്‌സിഡേഷൻ, കെറ്റോൺ മെറ്റബോളിസം പ്രക്രിയകൾ (സ്ലോ ഫൈബറുകൾ), മയോഫിലമെന്റ്/പേശി സങ്കോചം (യഥാക്രമം വേഗതയേറിയതും വേഗതയേറിയതുമായ ഫൈബറുകൾ), കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ് കാറ്റബോളിക് പ്രക്രിയകൾ (ഫാസ്റ്റ് ഫൈബറുകൾ) തുടങ്ങിയ പ്രതീക്ഷിച്ച വ്യത്യാസങ്ങൾ വെളിപ്പെടുത്തി. ഗ്ലൈക്കോജൻ മെറ്റബോളിസത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്നതായി അറിയപ്പെടുന്ന റെഗുലേറ്ററി, കാറ്റലറ്റിക് ഫോസ്ഫേറ്റസ് ഉപയൂണിറ്റുകൾ (PPP3CB, PPP1R3D, PPP1R3A) പോലുള്ള സവിശേഷതകളാൽ നയിക്കപ്പെടുന്ന ഫാസ്റ്റ് ഫൈബറുകളിൽ സെറിൻ/ത്രിയോണിൻ പ്രോട്ടീൻ ഫോസ്ഫേറ്റസ് പ്രവർത്തനവും വർദ്ധിച്ചു (47) (സപ്ലിമെന്റൽ ഫിഗറുകൾ 8D–E). വേഗതയേറിയ നാരുകളാൽ സമ്പുഷ്ടമാക്കപ്പെട്ട മറ്റ് പാതകളിൽ പ്രോട്ടിയോമിലെ പ്രോസസ്സിംഗ് (P-) ബോഡികൾ (YTHDF3, TRIM21, LSM2) (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8F), പോസ്റ്റ്-ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ റെഗുലേഷനിൽ (48) ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കാൻ സാധ്യതയുണ്ട്, ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഫാക്ടർ ആക്റ്റിവിറ്റി (SREBF1, RXRG, RORA) എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8G). ഓക്സിഡോറെഡക്റ്റേസ് ആക്റ്റിവിറ്റി (BDH1, DCXR, TXN2) (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8H), അമൈഡ് ബൈൻഡിംഗ് (CPTP, PFDN2, CRYAB) (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8I), എക്സ്ട്രാസെല്ലുലാർ മാട്രിക്സ് (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8J), റിസപ്റ്റർ-ലിഗാൻഡ് ആക്റ്റിവിറ്റി (FNDC5, SPX, NENF) (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8K) എന്നിവയിൽ സ്ലോ നാരുകൾ സമ്പുഷ്ടമാക്കപ്പെട്ടു.
മന്ദഗതിയിലുള്ള/വേഗതയേറിയ മസിൽ ഫൈബർ തരം സ്വഭാവസവിശേഷതകൾക്ക് അടിസ്ഥാനമായ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ നിയന്ത്രണത്തെക്കുറിച്ച് കൂടുതൽ ഉൾക്കാഴ്ച ലഭിക്കുന്നതിന്, SCENIC49 (സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ സെറ്റ് 14) ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഫാക്ടർ സമ്പുഷ്ടീകരണ വിശകലനം നടത്തി. വേഗതയേറിയതും വേഗതയേറിയതുമായ പേശി നാരുകൾക്കിടയിൽ നിരവധി ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങൾ ഗണ്യമായി സമ്പുഷ്ടമാക്കി (ചിത്രം 4E). ഇതിൽ മുമ്പ് വേഗത്തിലുള്ള പേശി നാരുകളുടെ വികാസവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരുന്ന MAFA പോലുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളും, 50 കൂടാതെ മുമ്പ് പേശി നാരുകളുടെ തരം-നിർദ്ദിഷ്ട ജീൻ പ്രോഗ്രാമുകളുമായി ബന്ധമില്ലാത്ത നിരവധി ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളും ഉൾപ്പെടുന്നു. ഇവയിൽ, PITX1, EGR1, MYF6 എന്നിവ വേഗതയേറിയ പേശി നാരുകളിൽ ഏറ്റവും സമ്പുഷ്ടമായ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളായിരുന്നു (ചിത്രം 4E). ഇതിനു വിപരീതമായി, മന്ദഗതിയിലുള്ള പേശി നാരുകളിൽ ഏറ്റവും സമ്പുഷ്ടമായ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളായിരുന്നു ZSCAN30, EPAS1 (HIF2A എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു) (ചിത്രം 4E). ഇതിന് അനുസൃതമായി, വേഗതയേറിയ പേശി നാരുകൾക്ക് അനുസൃതമായി UMAP മേഖലയിൽ ഉയർന്ന തലങ്ങളിൽ MAFA പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെട്ടു, അതേസമയം EPAS1 ന് വിപരീത എക്സ്പ്രഷൻ പാറ്റേൺ ഉണ്ടായിരുന്നു (ചിത്രം 4F).
അറിയപ്പെടുന്ന പ്രോട്ടീൻ-കോഡിംഗ് ജീനുകൾക്ക് പുറമേ, മനുഷ്യ വികാസത്തിന്റെയും രോഗത്തിന്റെയും നിയന്ത്രണത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടേക്കാവുന്ന നിരവധി നോൺ-കോഡിംഗ് ആർ‌എൻ‌എ ബയോടൈപ്പുകൾ ഉണ്ട്. 51, 52 ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോം ഡാറ്റാസെറ്റുകളിൽ, നിരവധി നോൺ-കോഡിംഗ് ആർ‌എൻ‌എകൾ ​​ഫൈബർ തരം പ്രത്യേകത കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 5A ഉം സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റാസെറ്റ് 15 ഉം), ഇതിൽ LINC01405 ഉൾപ്പെടുന്നു, ഇത് മന്ദഗതിയിലുള്ള നാരുകൾക്ക് വളരെ നിർദ്ദിഷ്ടമാണ്, കൂടാതെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മയോപ്പതി രോഗികളിൽ പേശികളിൽ കുറവുണ്ടാകുമെന്ന് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെടുന്നു. 53 ഇതിനു വിപരീതമായി, lnc-ERCC5-5 ജീനുമായി (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54 പൊരുത്തപ്പെടുന്ന RP11-255P5.3, വേഗത്തിലുള്ള ഫൈബർ തരം പ്രത്യേകത കാണിക്കുന്നു. LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) ഉം RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) ഉം അസ്ഥികൂട പേശികളുടെ പ്രത്യേകത പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ഫിഗേഴ്സ് 9A–B) കൂടാതെ അവയുടെ 1 Mb ജീനോമിക് അയൽപക്കത്ത് അറിയപ്പെടുന്ന കോൺട്രാക്റ്റൈൽ ജീനുകൾ ഇല്ല, ഇത് അയൽ കോൺട്രാക്റ്റൈൽ ജീനുകളെ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിനുപകരം ഫൈബർ തരങ്ങളെ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിൽ അവ ഒരു പ്രത്യേക പങ്ക് വഹിക്കുന്നുണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. യഥാക്രമം LINC01405 ഉം RP11-255P5.3 ഉം സ്ലോ/ഫാസ്റ്റ് ഫൈബർ തരം-നിർദ്ദിഷ്ട എക്സ്പ്രഷൻ പ്രൊഫൈലുകൾ RNAസ്കോപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് സ്ഥിരീകരിച്ചു (ചിത്രങ്ങൾ 5B–C).
A. കോഡിംഗ് അല്ലാത്ത RNA ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ സ്ലോ-ഉം ഫാസ്റ്റ്-ട്വിച്ച് പേശി നാരുകളിലും ഗണ്യമായി നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്നു. B. LINC01405, RP11-255P5.3 എന്നിവയുടെ സ്ലോ-ഉം ഫാസ്റ്റ്-ട്വിച്ച് ഫൈബർ തരം പ്രത്യേകത യഥാക്രമം കാണിക്കുന്ന പ്രതിനിധി RNAസ്കോപ്പ് ചിത്രങ്ങൾ. സ്കെയിൽ ബാർ = 50 μm. C. RNAസ്കോപ്പ് നിർണ്ണയിക്കുന്ന മയോഫൈബർ തരം-നിർദ്ദിഷ്ട നോൺ-കോഡിംഗ് RNA എക്സ്പ്രഷന്റെ അളവ് (n = സ്വതന്ത്ര വ്യക്തികളിൽ നിന്നുള്ള 3 ബയോപ്സികൾ, ഓരോ വ്യക്തിയിലും വേഗതയേറിയതും വേഗതയേറിയതുമായ പേശി നാരുകൾ താരതമ്യം ചെയ്യുന്നു). രണ്ട് വാലുള്ള വിദ്യാർത്ഥിയുടെ ടി-ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ചാണ് സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനം നടത്തിയത്. ബോക്സ് പ്ലോട്ടുകൾ മീഡിയൻ, ഒന്നും മൂന്നും ക്വാർട്ടൈലുകൾ കാണിക്കുന്നു, ഏറ്റവും കുറഞ്ഞതും പരമാവധി മൂല്യങ്ങളും ചൂണ്ടിക്കാണിക്കുന്ന വിസ്കറുകൾ. D. ഡി നോവോ മൈക്രോബയൽ പ്രോട്ടീൻ ഐഡന്റിഫിക്കേഷൻ വർക്ക്ഫ്ലോ (BioRender.com ഉപയോഗിച്ച് സൃഷ്ടിച്ചത്). E. മൈക്രോബയൽ പ്രോട്ടീൻ LINC01405_ORF408:17441:17358 പ്രത്യേകമായി സ്ലോ സ്കെലിറ്റൽ പേശി നാരുകളിൽ പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു (ഓരോ പങ്കാളിയുടെയും വേഗതയേറിയതും വേഗത കുറഞ്ഞതുമായ പേശി നാരുകൾ താരതമ്യം ചെയ്തുകൊണ്ട്, സ്വതന്ത്ര പങ്കാളികളിൽ നിന്നുള്ള n=5 ബയോപ്സികൾ). ഒരു അനുഭവപരമായ ബയേസിയൻ സമീപനവുമായി സംയോജിപ്പിച്ച് ലിം ലീനിയർ മോഡൽ രീതി ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനം നടത്തി, തുടർന്ന് p-മൂല്യം ക്രമീകരണവുമായി ഒന്നിലധികം താരതമ്യങ്ങൾക്കായി ബെഞ്ചമിനി-ഹോച്ച്ബർഗ് രീതി ഉപയോഗിച്ചു. ബോക്സ് പ്ലോട്ടുകൾ പരമാവധി/മിനിമം മൂല്യങ്ങളിലേക്ക് വിരൽ ചൂണ്ടുന്ന മീശകളോടെ, മീഡിയൻ, ഒന്നാമത്തെയും മൂന്നാമത്തെയും ക്വാർട്ടൈലുകൾ കാണിക്കുന്നു.
അടുത്തിടെ, നിരവധി അനുമാനിത നോൺ-കോഡിംഗ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ ട്രാൻസ്ക്രൈബ് ചെയ്ത മൈക്രോബയൽ പ്രോട്ടീനുകളെ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്നുവെന്ന് പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്, അവയിൽ ചിലത് പേശികളുടെ പ്രവർത്തനത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്നു. 44, 55 സാധ്യതയുള്ള ഫൈബർ തരം സ്പെസിഫിസിറ്റി ഉള്ള മൈക്രോബയൽ പ്രോട്ടീനുകളെ തിരിച്ചറിയാൻ, 1000 ഫൈബർ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോം ഡാറ്റാസെറ്റിൽ (ചിത്രം 5D) കാണപ്പെടുന്ന നോൺ-കോഡിംഗ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളുടെ (n = 305) ക്രമങ്ങൾ അടങ്ങിയ ഒരു കസ്റ്റം FASTA ഫയൽ ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ ഞങ്ങളുടെ 1000 ഫൈബർ പ്രോട്ടീനോം ഡാറ്റാസെറ്റ് തിരഞ്ഞു. 22 വ്യത്യസ്ത ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളിൽ നിന്ന് 197 മൈക്രോബയൽ പ്രോട്ടീനുകൾ ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു, അവയിൽ 71 എണ്ണം സ്ലോ, ഫാസ്റ്റ് സ്കെലിറ്റൽ പേശി നാരുകൾക്കിടയിൽ വ്യത്യസ്തമായി നിയന്ത്രിക്കപ്പെട്ടു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 9C, സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ സെറ്റ് 16). LINC01405 ന്, മൂന്ന് മൈക്രോബയൽ പ്രോട്ടീൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു, അവയിലൊന്ന് അതിന്റെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റിന് സമാനമായ സ്ലോ ഫൈബർ സ്പെസിഫിസിറ്റി കാണിച്ചു (ചിത്രം 5E, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 9D). അങ്ങനെ, സ്ലോ സ്കെലിറ്റൽ പേശി നാരുകൾക്ക് പ്രത്യേകമായി ഒരു മൈക്രോബയൽ പ്രോട്ടീൻ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്ന ഒരു ജീൻ ആയി ഞങ്ങൾ LINC01405 നെ തിരിച്ചറിഞ്ഞു.
വ്യക്തിഗത പേശി നാരുകളുടെ വലിയ തോതിലുള്ള പ്രോട്ടിയോമിക് സ്വഭാവരൂപീകരണത്തിനും ആരോഗ്യകരമായ അവസ്ഥകളിലെ ഫൈബർ വൈവിധ്യത്തിന്റെ തിരിച്ചറിഞ്ഞ റെഗുലേറ്ററുകൾക്കുമായി ഞങ്ങൾ ഒരു സമഗ്രമായ വർക്ക്ഫ്ലോ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു. നെമാലിൻ മയോപ്പതികൾ അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ വൈവിധ്യത്തെ എങ്ങനെ ബാധിക്കുന്നു എന്ന് മനസ്സിലാക്കാൻ ഞങ്ങൾ ഈ വർക്ക്ഫ്ലോ പ്രയോഗിച്ചു. പേശി ബലഹീനതയ്ക്ക് കാരണമാകുന്ന പാരമ്പര്യ പേശി രോഗങ്ങളാണ് നെമാലിൻ മയോപ്പതികൾ, കൂടാതെ ബാധിതരായ കുട്ടികളിൽ ശ്വസന ബുദ്ധിമുട്ട്, സ്കോളിയോസിസ്, പരിമിതമായ കൈകാലുകളുടെ ചലനശേഷി എന്നിവയുൾപ്പെടെ നിരവധി സങ്കീർണതകൾ ഉണ്ടാകുന്നു. 19,20 സാധാരണയായി, നെമാലിൻ മയോപ്പതികളിൽ, ആക്റ്റിൻ ആൽഫ 1 (ACTA1) പോലുള്ള ജീനുകളിലെ രോഗകാരി വകഭേദങ്ങൾ സ്ലോ-ട്വിച്ച് ഫൈബർ മയോഫൈബർ ഘടനയുടെ ആധിപത്യത്തിന് കാരണമാകുന്നു, എന്നിരുന്നാലും ഈ പ്രഭാവം വൈവിധ്യപൂർണ്ണമാണ്. ഒരു ശ്രദ്ധേയമായ അപവാദം ട്രോപോണിൻ T1 നെമാലിൻ മയോപ്പതി (TNNT1) ആണ്, ഇതിന് വേഗതയേറിയ നാരുകളുടെ ആധിപത്യമുണ്ട്. അതിനാൽ, നെമാലിൻ മയോപ്പതികളിൽ കാണപ്പെടുന്ന അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ ക്രമക്കേടിനെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള വൈവിധ്യത്തെക്കുറിച്ചുള്ള മികച്ച ധാരണ ഈ രോഗങ്ങൾക്കും മയോഫൈബർ തരത്തിനും ഇടയിലുള്ള സങ്കീർണ്ണമായ ബന്ധം അനാവരണം ചെയ്യാൻ സഹായിച്ചേക്കാം.
ആരോഗ്യകരമായ നിയന്ത്രണ സംവിധാനങ്ങളുമായി (ഒരു ഗ്രൂപ്പിന് n=3) താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, ACTA1, TNNT1 ജീനുകളിൽ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ ഉള്ള നെമാലിൻ മയോപ്പതി രോഗികളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത മയോഫൈബറുകൾ, മയോഫൈബർ അട്രോഫി അല്ലെങ്കിൽ ഡിസ്ട്രോഫി കാണിച്ചു (ചിത്രം 6A, സപ്ലിമെന്ററി പട്ടിക 3). ലഭ്യമായ വസ്തുക്കളുടെ പരിമിതമായ അളവ് കാരണം ഇത് പ്രോട്ടിയോമിക് വിശകലനത്തിന് കാര്യമായ സാങ്കേതിക വെല്ലുവിളികൾ സൃഷ്ടിച്ചു. ഇതൊക്കെയാണെങ്കിലും, 272 സ്കെലിറ്റൽ മയോഫൈബറുകളിൽ 2485 പ്രോട്ടീനുകൾ കണ്ടെത്താൻ ഞങ്ങൾക്ക് കഴിഞ്ഞു. ഒരു ഫൈബറിൽ കുറഞ്ഞത് 1000 ക്വാണ്ടിഫൈഡ് പ്രോട്ടീനുകൾ ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത ശേഷം, 250 നാരുകൾ തുടർന്നുള്ള ബയോഇൻഫോർമാറ്റിക്സ് വിശകലനത്തിന് വിധേയമാക്കി. ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത ശേഷം, ഒരു ഫൈബറിൽ ശരാശരി 1573 ± 359 പ്രോട്ടീനുകൾ അളക്കപ്പെട്ടു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 10A, സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ സെറ്റുകൾ 17–18). ഫൈബർ വലുപ്പത്തിൽ ഗണ്യമായ കുറവുണ്ടായിട്ടും, നെമാലിൻ മയോപ്പതി രോഗി സാമ്പിളുകളുടെ പ്രോട്ടീം ആഴം വളരെ കുറഞ്ഞു എന്നത് ശ്രദ്ധേയമാണ്. മാത്രമല്ല, ഞങ്ങളുടെ സ്വന്തം FASTA ഫയലുകൾ (കോഡിംഗ് അല്ലാത്ത ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ ഉൾപ്പെടെ) ഉപയോഗിച്ച് ഈ ഡാറ്റ പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുന്നത് നെമാലിൻ മയോപ്പതി രോഗികളിൽ നിന്ന് സ്കെലിറ്റൽ മയോഫൈബറുകളിലെ അഞ്ച് മൈക്രോബയൽ പ്രോട്ടീനുകളെ തിരിച്ചറിയാൻ ഞങ്ങളെ അനുവദിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ സെറ്റ് 19). പ്രോട്ടിയോമിന്റെ ഡൈനാമിക് ശ്രേണി ഗണ്യമായി വിശാലമായിരുന്നു, കൂടാതെ നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പിലെ മൊത്തം പ്രോട്ടീനുകൾ മുമ്പത്തെ 1000-ഫൈബർ പ്രോട്ടീനോം വിശകലനത്തിന്റെ ഫലങ്ങളുമായി നന്നായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 10B–C).
A. ACTA1, TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതികളിൽ (NM) MYH അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഫൈബർ അട്രോഫി അല്ലെങ്കിൽ ഡിസ്ട്രോഫിയും വ്യത്യസ്ത ഫൈബർ തരങ്ങളുടെ ആധിപത്യവും കാണിക്കുന്ന സൂക്ഷ്മ ചിത്രങ്ങൾ. സ്കെയിൽ ബാർ = 100 μm. ACTA1, TNNT1 രോഗികളിൽ സ്റ്റെയിനിംഗിന്റെ പുനരുൽപാദനക്ഷമത ഉറപ്പാക്കാൻ, പ്രതിനിധി ചിത്രങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിന് മുമ്പ് മൂന്ന് രോഗി ബയോപ്സികൾ രണ്ടോ മൂന്നോ തവണ (ഒരു കേസിൽ നാല് വിഭാഗങ്ങൾ) സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തു. B. MYH അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള പങ്കാളികളിൽ ഫൈബർ തരം അനുപാതങ്ങൾ. C. നെമാലിൻ മയോപ്പതികളും നിയന്ത്രണങ്ങളും ഉള്ള രോഗികളിൽ അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ പ്രധാന ഘടക വിശകലനം (PCA) പ്ലോട്ട്. D. ചിത്രം 2-ൽ വിശകലനം ചെയ്ത 1000 നാരുകളിൽ നിന്ന് നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ട ഒരു PCA പ്ലോട്ടിലേക്ക് പ്രൊജക്റ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്ന നെമാലിൻ മയോപ്പതികളും നിയന്ത്രണങ്ങളും ഉള്ള രോഗികളിൽ നിന്നുള്ള അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകൾ. ഉദാഹരണത്തിന്, ACTA1, TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതികളും നിയന്ത്രണങ്ങളും ഉള്ള പങ്കാളികൾക്കിടയിലും ACTA1, TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതികൾ ഉള്ള പങ്കാളികൾക്കിടയിലും വ്യത്യാസങ്ങൾ താരതമ്യം ചെയ്യുന്ന അഗ്നിപർവ്വത പ്ലോട്ടുകൾ. നിറമുള്ള വൃത്തങ്ങൾ π < 0.05 ൽ ഗണ്യമായി വ്യത്യാസപ്പെട്ട പ്രോട്ടീനുകളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, ഇരുണ്ട ഡോട്ടുകൾ FDR < 0.05 ൽ ഗണ്യമായി വ്യത്യാസപ്പെട്ട പ്രോട്ടീനുകളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ലിംമ ലീനിയർ മോഡൽ രീതിയും അനുഭവപരമായ ബയേസിയൻ രീതികളും ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനം നടത്തി, തുടർന്ന് ബെഞ്ചമിനി-ഹോച്ച്ബർഗ് രീതി ഉപയോഗിച്ച് ഒന്നിലധികം താരതമ്യങ്ങൾക്കായി പി-മൂല്യം ക്രമീകരണം നടത്തി. H. മുഴുവൻ പ്രോട്ടീമിലും ടൈപ്പ് 1, 2A നാരുകളിലും ഗണ്യമായി വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളുടെ സമ്പുഷ്ടീകരണ വിശകലനം. ക്ലസ്റ്റർപ്രൊഫൈലർ പാക്കേജും ബെഞ്ചമിനി-ഹോച്ച്ബർഗ് ക്രമീകരിച്ച പി-മൂല്യങ്ങളും ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനം നടത്തി. I, J. എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ മാട്രിക്സും മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ജീൻ ഓൺടോളജി (GO) പദങ്ങളും ഉപയോഗിച്ച് പ്രിൻസിപ്പൽ കമ്പോണന്റ് അനാലിസിസ് (PCA) പ്ലോട്ടുകൾ വർണ്ണിച്ചു.
നെമാലിൻ മയോപ്പതികൾ അസ്ഥികൂട പേശികളിലെ MYH-പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന മയോഫൈബർ തരങ്ങളുടെ അനുപാതത്തെ സ്വാധീനിക്കുന്നതിനാൽ,19,20 നെമാലിൻ മയോപ്പതികളും നിയന്ത്രണങ്ങളും ഉള്ള രോഗികളിൽ MYH-പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന മയോഫൈബർ തരങ്ങൾ ഞങ്ങൾ ആദ്യം പരിശോധിച്ചു. 1000 മയോഫൈബർ അസ്സേയ്‌ക്കായി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 10D–E) മുമ്പ് വിവരിച്ച ഒരു പക്ഷപാതമില്ലാത്ത രീതി ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ മയോഫൈബർ തരം നിർണ്ണയിച്ചു, വീണ്ടും ശുദ്ധമായ 2X മയോഫൈബറുകൾ തിരിച്ചറിയുന്നതിൽ പരാജയപ്പെട്ടു (ചിത്രം 6B). ACTA1 മ്യൂട്ടേഷനുകൾ ഉള്ള രണ്ട് രോഗികൾക്ക് ടൈപ്പ് 1 മയോഫൈബറുകളുടെ അനുപാതം വർദ്ധിച്ചപ്പോൾ, TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതി ഉള്ള രണ്ട് രോഗികൾക്ക് ടൈപ്പ് 1 മയോഫൈബറുകളുടെ അനുപാതം കുറഞ്ഞതിനാൽ, മയോഫൈബർ തരത്തിൽ നെമാലിൻ മയോപ്പതികളുടെ വൈവിധ്യമാർന്ന പ്രഭാവം ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം 6B). തീർച്ചയായും, ACTA1-നെമാലിൻ മയോപ്പതികളിൽ MYH2, ഫാസ്റ്റ് ട്രോപോണിൻ ഐസോഫോമുകൾ (TNNC2, TNNI2, TNNT3) എന്നിവയുടെ പ്രകടനത്തിൽ കുറവുണ്ടായി, അതേസമയം TNNT1-നെമാലിൻ മയോപ്പതികളിൽ MYH7 എക്സ്പ്രഷൻ കുറഞ്ഞു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 11A). നെമാലിൻ മയോപ്പതികളിലെ വൈവിധ്യമാർന്ന മയോഫൈബർ തരം സ്വിച്ചിംഗിന്റെ മുൻ റിപ്പോർട്ടുകളുമായി ഇത് പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.19,20 ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിസ്ട്രി വഴി ഞങ്ങൾ ഈ ഫലങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു, ACTA1-നെമാലിൻ മയോപ്പതി ഉള്ള രോഗികൾക്ക് ടൈപ്പ് 1 മയോഫൈബറുകളുടെ ആധിപത്യമുണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, അതേസമയം TNNT1-നെമാലിൻ മയോപ്പതി ഉള്ള രോഗികൾക്ക് വിപരീത പാറ്റേൺ ഉണ്ടായിരുന്നു (ചിത്രം 6A).
സിംഗിൾ-ഫൈബർ പ്രോട്ടീം തലത്തിൽ, ACTA1, TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതി രോഗികളിൽ നിന്നുള്ള അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകൾ മിക്ക നിയന്ത്രണ നാരുകളുമായും കൂട്ടമായി കാണപ്പെടുന്നു, TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതി നാരുകളാണ് സാധാരണയായി ഏറ്റവും ഗുരുതരമായി ബാധിക്കപ്പെടുന്നത് (ചിത്രം 6C). ഓരോ രോഗിക്കും വേണ്ടിയുള്ള സ്യൂഡോ-ഇൻഫ്ലേറ്റഡ് നാരുകളുടെ പ്രിൻസിപ്പൽ കമ്പോണന്റ് അനാലിസിസ് (PCA) പ്ലോട്ടുകൾ പ്ലോട്ട് ചെയ്യുമ്പോൾ ഇത് പ്രത്യേകിച്ചും വ്യക്തമായി, TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതി രോഗികൾ 2 ഉം 3 ഉം നിയന്ത്രണ സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് ഏറ്റവും അകലെയായി കാണപ്പെടുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 11B, സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ സെറ്റ് 20). മയോപ്പതി രോഗികളിൽ നിന്നുള്ള നാരുകൾ ആരോഗ്യകരമായ നാരുകളുമായി എങ്ങനെ താരതമ്യം ചെയ്യുന്നുവെന്ന് നന്നായി മനസ്സിലാക്കാൻ, ആരോഗ്യമുള്ള മുതിർന്ന പങ്കാളികളിൽ നിന്ന് 1,000 നാരുകളുടെ പ്രോട്ടിയോമിക് വിശകലനത്തിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച വിശദമായ വിവരങ്ങൾ ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു. 1000-ഫൈബർ പ്രോട്ടിയോമിക് വിശകലനത്തിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച PCA പ്ലോട്ടിലേക്ക് മയോപ്പതി ഡാറ്റാസെറ്റിൽ (ACTA1, TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതി രോഗികളും നിയന്ത്രണങ്ങളും) നിന്നുള്ള നാരുകൾ ഞങ്ങൾ പ്രൊജക്റ്റ് ചെയ്തു (ചിത്രം 6D). നിയന്ത്രണ നാരുകളിൽ PC2 ലൂടെ MYH ഫൈബർ തരങ്ങളുടെ വിതരണം 1000-ഫൈബർ പ്രോട്ടിയോമിക് വിശകലനത്തിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച ഫൈബർ വിതരണത്തിന് സമാനമായിരുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, നെമാലിൻ മയോപ്പതി രോഗികളിലെ മിക്ക നാരുകളും അവരുടെ നേറ്റീവ് MYH ഫൈബർ തരം പരിഗണിക്കാതെ, ആരോഗ്യകരമായ ഫാസ്റ്റ്-ട്വിച്ച് നാരുകളുമായി ഓവർലാപ്പ് ചെയ്തുകൊണ്ട് PC2 താഴേക്ക് മാറി. അങ്ങനെ, MYH അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള രീതികൾ ഉപയോഗിച്ച് അളക്കുമ്പോൾ ACTA1 നെമാലിൻ മയോപ്പതി ഉള്ള രോഗികൾ ടൈപ്പ് 1 നാരുകളിലേക്ക് ഒരു മാറ്റം കാണിച്ചെങ്കിലും, ACTA1 നെമാലിൻ മയോപ്പതിയും TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതിയും അസ്ഥികൂട പേശി ഫൈബർ പ്രോട്ടിയോമിനെ ഫാസ്റ്റ്-ട്വിച്ച് നാരുകളിലേക്ക് മാറ്റി.
തുടർന്ന് ഞങ്ങൾ ഓരോ രോഗി ഗ്രൂപ്പിനെയും ആരോഗ്യകരമായ നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പുകളുമായി നേരിട്ട് താരതമ്യം ചെയ്യുകയും ACTA1, TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതികളിൽ യഥാക്രമം 256 ഉം 552 ഉം വ്യത്യസ്തമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളെ തിരിച്ചറിയുകയും ചെയ്തു (ചിത്രം 6E–G ഉം സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 11C ഉം, സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ സെറ്റ് 21). ജീൻ സമ്പുഷ്ടീകരണ വിശകലനം മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രോട്ടീനുകളിൽ ഏകോപിതമായ കുറവ് വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം 6H–I, സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ സെറ്റ് 22). അതിശയകരമെന്നു പറയട്ടെ, ACTA1, TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതികളിൽ ഫൈബർ തരങ്ങളുടെ വ്യത്യസ്ത ആധിപത്യം ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, ഈ കുറവ് MYH-അധിഷ്ഠിത ഫൈബർ തരത്തിൽ നിന്ന് പൂർണ്ണമായും സ്വതന്ത്രമായിരുന്നു (ചിത്രം 6H ഉം സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രങ്ങൾ 11D–I ഉം, സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ സെറ്റ് 23). ACTA1 അല്ലെങ്കിൽ TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതികളിൽ മൂന്ന് മൈക്രോബയൽ പ്രോട്ടീനുകളും നിയന്ത്രിക്കപ്പെട്ടു. ഈ മൈക്രോപ്രോട്ടീനുകളിൽ രണ്ടെണ്ണം, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (LINC00598 അല്ലെങ്കിൽ Lnc-FOXO1 എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു), ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2) എന്നിവ ടൈപ്പ് 1 മയോഫൈബറുകളിൽ മാത്രമേ വ്യത്യസ്ത സമൃദ്ധി കാണിച്ചിട്ടുള്ളൂ. ENSG00000215483_TR14_ORF67 സെൽ സൈക്കിൾ നിയന്ത്രണത്തിൽ ഒരു പങ്കു വഹിക്കുന്നതായി മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. 56 മറുവശത്ത്, ആരോഗ്യകരമായ നിയന്ത്രണങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ACTA1-നെമാലിൻ മയോപ്പതിയിലെ ടൈപ്പ് 1, ടൈപ്പ് 2A മയോഫൈബറുകളിൽ ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798 ന് അനുസൃതമായി) വർദ്ധിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 12A, സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ സെറ്റ് 24). ഇതിനു വിപരീതമായി, റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീനുകളെ നെമാലിൻ മയോപ്പതി വലിയ തോതിൽ ബാധിച്ചില്ല, എന്നിരുന്നാലും ACTA1 നെമാലിൻ മയോപ്പതിയിൽ RPS17 കുറഞ്ഞ നിയന്ത്രണം പാലിച്ചു (ചിത്രം 6E).
സമ്പുഷ്ടീകരണ വിശകലനം ACTA1, TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതികളിൽ രോഗപ്രതിരോധ സംവിധാന പ്രക്രിയകളുടെ അപ്‌റെഗുലേഷൻ വെളിപ്പെടുത്തി, അതേസമയം TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതിയിലും സെൽ അഡീഷൻ വർദ്ധിച്ചു (ചിത്രം 6H). എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ മാട്രിക്സ് പ്രോട്ടീനുകൾ PC1, PC2 എന്നിവയിലെ PCA നെ നെഗറ്റീവ് ദിശയിലേക്ക് മാറ്റുന്നതിലൂടെ ഈ എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ ഘടകങ്ങളുടെ സമ്പുഷ്ടീകരണം പ്രതിഫലിച്ചു (അതായത്, ഏറ്റവും കൂടുതൽ ബാധിച്ച നാരുകളിലേക്ക്) (ചിത്രം 6J). രോഗപ്രതിരോധ പ്രതികരണങ്ങളിലും സാർക്കോലെമ്മൽ നന്നാക്കൽ സംവിധാനങ്ങളിലും ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ പ്രോട്ടീനുകളുടെ വർദ്ധിച്ച പ്രകടനമാണ് രണ്ട് രോഗി ഗ്രൂപ്പുകളും കാണിച്ചത്, ഉദാഹരണത്തിന് അനെക്സിനുകൾ (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58, അവയുടെ സംവേദനാത്മക പ്രോട്ടീൻ S100A1159 (സപ്ലിമെന്ററി ഫിഗറുകൾ 12B–C). മസ്കുലർ ഡിസ്ട്രോഫികളിൽ ഈ പ്രക്രിയ മെച്ചപ്പെട്ടതായി മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്60, എന്നാൽ, ഞങ്ങളുടെ അറിവിൽ, മുമ്പ് നെമാലിൻ മയോപ്പതികളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിട്ടില്ല. പരിക്കിനെത്തുടർന്ന് സാർക്കോലെമ്മൽ നന്നാക്കലിനും പുതുതായി രൂപംകൊണ്ട മയോസൈറ്റുകളുടെ മയോഫൈബറുകളുമായുള്ള സംയോജനത്തിനും ഈ തന്മാത്രാ യന്ത്രത്തിന്റെ സാധാരണ പ്രവർത്തനം ആവശ്യമാണ്58,61. അങ്ങനെ, രണ്ട് രോഗി ഗ്രൂപ്പുകളിലും ഈ പ്രക്രിയയുടെ വർദ്ധിച്ച പ്രവർത്തനം, മയോഫൈബർ അസ്ഥിരത മൂലമുണ്ടാകുന്ന പരിക്കിനുള്ള ഒരു നഷ്ടപരിഹാര പ്രതികരണത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ഓരോ നെമാലിൻ മയോപ്പതിയുടെയും ഫലങ്ങൾ പരസ്പരം ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (r = 0.736) കൂടാതെ ന്യായമായ ഓവർലാപ്പ് കാണിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രങ്ങൾ 11A–B), ACTA1 ഉം TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതിയും പ്രോട്ടീമിൽ സമാനമായ ഫലങ്ങൾ ചെലുത്തുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, ചില പ്രോട്ടീനുകൾ ACTA1 അല്ലെങ്കിൽ TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതിയിൽ മാത്രമേ നിയന്ത്രിക്കപ്പെട്ടിട്ടുള്ളൂ (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രങ്ങൾ 11A ഉം C ഉം). TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതിയിലെ ഏറ്റവും ഉയർന്ന അളവിൽ നിയന്ത്രിക്കപ്പെട്ട പ്രോട്ടീനുകളിൽ ഒന്നായിരുന്നു MFAP4 എന്ന പ്രോഫൈബ്രോട്ടിക് പ്രോട്ടീൻ, എന്നാൽ ACTA1 നെമാലിൻ മയോപ്പതിയിൽ മാറ്റമില്ലാതെ തുടർന്നു. HOX ജീൻ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിന് ഉത്തരവാദികളായ PAF1C സമുച്ചയത്തിന്റെ ഒരു ഘടകമായ SKIC8, TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതിയിൽ കുറഞ്ഞ നിയന്ത്രണത്തിലായിരുന്നു, പക്ഷേ ACTA1 നെമാലിൻ മയോപ്പതിയിൽ ബാധിച്ചില്ല (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 11A). ACTA1, TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതി എന്നിവയുടെ നേരിട്ടുള്ള താരതമ്യം, TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതിയിൽ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രോട്ടീനുകളിൽ കൂടുതൽ കുറവുകളും രോഗപ്രതിരോധ സംവിധാന പ്രോട്ടീനുകളിൽ വർദ്ധനവും വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം 6G–H ഉം അനുബന്ധ ചിത്രങ്ങൾ 11C ഉം 11H–I ഉം). TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതിയുമായി (ചിത്രം 6A) താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതിയിൽ കാണപ്പെടുന്ന വലിയ അട്രോഫി/ഡിസ്ട്രോഫിയുമായി ഈ ഡാറ്റ പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, ഇത് TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതി രോഗത്തിന്റെ കൂടുതൽ കഠിനമായ രൂപത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
നെമാലിൻ മയോപ്പതിയുടെ നിരീക്ഷിച്ച ഫലങ്ങൾ മുഴുവൻ പേശി തലത്തിലും നിലനിൽക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് വിലയിരുത്താൻ, TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതി രോഗികളിൽ നിന്നുള്ള പേശി ബയോപ്‌സികളുടെ ഒരു ബൾക്ക് പ്രോട്ടിയോമിക് വിശകലനം ഞങ്ങൾ നടത്തി, അവരെ നിയന്ത്രണങ്ങളുമായി (ഒരു ഗ്രൂപ്പിന് n=3) താരതമ്യം ചെയ്തു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 13A, സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ സെറ്റ് 25). പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, പ്രധാന ഘടക വിശകലനത്തിൽ നിയന്ത്രണങ്ങൾ അടുത്ത ബന്ധമുള്ളവയായിരുന്നു, അതേസമയം TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതി രോഗികൾ സിംഗിൾ ഫൈബർ വിശകലനത്തിൽ കാണുന്നതുപോലെ ഉയർന്ന ഇന്റർസാമ്പിൾ വേരിയബിളിറ്റി പ്രകടമാക്കി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 13B). വ്യക്തിഗത നാരുകൾ താരതമ്യം ചെയ്തുകൊണ്ട് ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്‌ത വ്യത്യസ്തമായി പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെട്ട പ്രോട്ടീനുകളും (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 13C, സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ സെറ്റ് 26) ജൈവ പ്രക്രിയകളും (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 13D, സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ സെറ്റ് 27) ബൾക്ക് വിശകലനം പുനർനിർമ്മിച്ചു, പക്ഷേ വ്യത്യസ്ത ഫൈബർ തരങ്ങൾ തമ്മിൽ വേർതിരിച്ചറിയാനുള്ള കഴിവ് നഷ്ടപ്പെട്ടു, നാരുകളിലുടനീളമുള്ള വൈവിധ്യമാർന്ന രോഗ ഫലങ്ങൾ കണക്കിലെടുക്കുന്നതിൽ പരാജയപ്പെട്ടു.
ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, ഇമ്മ്യൂണോബ്ലോട്ടിംഗ് പോലുള്ള ലക്ഷ്യ രീതികളിലൂടെ കണ്ടെത്താനാകാത്ത ക്ലിനിക്കൽ ബയോളജിക്കൽ സവിശേഷതകൾ സിംഗിൾ-മയോഫൈബർ പ്രോട്ടിയോമിക്സിന് വ്യക്തമാക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഈ ഡാറ്റ തെളിയിക്കുന്നു. മാത്രമല്ല, ഫിനോടൈപ്പിക് അഡാപ്റ്റേഷൻ വിവരിക്കാൻ ആക്റ്റിൻ ഫൈബർ ടൈപ്പിംഗ് (MYH) മാത്രം ഉപയോഗിക്കുന്നതിന്റെ പരിമിതികൾ ഈ ഡാറ്റ എടുത്തുകാണിക്കുന്നു. വാസ്തവത്തിൽ, ആക്റ്റിൻ, ട്രോപോണിൻ നെമാലിൻ മയോപ്പതികൾക്കിടയിൽ ഫൈബർ തരം സ്വിച്ചിംഗ് വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരിക്കുമെങ്കിലും, രണ്ട് നെമാലിൻ മയോപ്പതികളും അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ മെറ്റബോളിസത്തിൽ നിന്ന് MYH ഫൈബർ ടൈപ്പിംഗിനെ വേഗമേറിയതും കുറഞ്ഞതുമായ ഓക്സിഡേറ്റീവ് മസിൽ പ്രോട്ടീമിലേക്ക് വിഘടിപ്പിക്കുന്നു.
ടിഷ്യൂകൾക്ക് അവയുടെ വൈവിധ്യമാർന്ന ആവശ്യങ്ങൾ നിറവേറ്റുന്നതിന് സെല്ലുലാർ വൈവിധ്യം നിർണായകമാണ്. അസ്ഥികൂട പേശികളിൽ, വ്യത്യസ്ത അളവിലുള്ള ബലപ്രയോഗവും ക്ഷീണവും സ്വഭാവ സവിശേഷതകളുള്ള ഫൈബർ തരങ്ങളായി ഇതിനെ പലപ്പോഴും വിശേഷിപ്പിക്കാറുണ്ട്. എന്നിരുന്നാലും, ഇത് അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ വേരിയബിളിറ്റിയുടെ ഒരു ചെറിയ ഭാഗം മാത്രമേ വിശദീകരിക്കുന്നുള്ളൂ എന്ന് വ്യക്തമാണ്, ഇത് മുമ്പ് കരുതിയിരുന്നതിനേക്കാൾ വളരെ വേരിയബിളും സങ്കീർണ്ണവും ബഹുമുഖവുമാണ്. സാങ്കേതിക പുരോഗതി ഇപ്പോൾ അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന ഘടകങ്ങളിലേക്ക് വെളിച്ചം വീശുന്നു. വാസ്തവത്തിൽ, ടൈപ്പ് 2X നാരുകൾ ഒരു പ്രത്യേക അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ ഉപവിഭാഗമായിരിക്കില്ലെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. മാത്രമല്ല, അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ വൈവിധ്യത്തിന്റെ പ്രധാന നിർണ്ണായക ഘടകങ്ങളായി മെറ്റബോളിക് പ്രോട്ടീനുകൾ, റൈബോസോമൽ പ്രോട്ടീനുകൾ, കോശ-അനുബന്ധ പ്രോട്ടീനുകൾ എന്നിവ ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു. നെമറ്റോഡ് മയോപ്പതി ഉള്ള രോഗികളുടെ സാമ്പിളുകളിൽ ഞങ്ങളുടെ പ്രോട്ടിയോമിക് വർക്ക്ഫ്ലോ പ്രയോഗിക്കുന്നതിലൂടെ, MYH അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഫൈബർ ടൈപ്പിംഗ് അസ്ഥികൂട പേശി വൈവിധ്യത്തെ പൂർണ്ണമായും പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നില്ലെന്ന് ഞങ്ങൾ കൂടുതൽ തെളിയിച്ചു, പ്രത്യേകിച്ച് സിസ്റ്റം അസ്വസ്ഥമാകുമ്പോൾ. വാസ്തവത്തിൽ, MYH അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഫൈബർ തരം പരിഗണിക്കാതെ തന്നെ, നെമറ്റോഡ് മയോപ്പതി വേഗതയേറിയതും കുറഞ്ഞതുമായ ഓക്സിഡേറ്റീവ് നാരുകളിലേക്ക് മാറുന്നു.
പത്തൊൻപതാം നൂറ്റാണ്ട് മുതൽ അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകൾ തരംതിരിച്ചിട്ടുണ്ട്. വ്യത്യസ്ത MYH ഫൈബർ തരങ്ങളുടെ എക്സ്പ്രഷൻ പ്രൊഫൈലുകളും വ്യത്യസ്ത ഉത്തേജകങ്ങളോടുള്ള അവയുടെ പ്രതികരണങ്ങളും മനസ്സിലാക്കാൻ ആരംഭിച്ചതായി സമീപകാല ഒമിക്സ് വിശകലനങ്ങൾ ഞങ്ങളെ അനുവദിച്ചു. ഇവിടെ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, ഒരു അസ്ഥികൂട പേശി നാരിന്റെ തരം നിർവചിക്കുന്നതിന് ഒരൊറ്റ (അല്ലെങ്കിൽ കുറച്ച്) മാർക്കറുകളുടെ അളവ് കണക്കാക്കാതെ, പരമ്പരാഗത ആന്റിബോഡി അധിഷ്ഠിത രീതികളേക്കാൾ ഫൈബർ തരം മാർക്കറുകൾ അളക്കുന്നതിന് കൂടുതൽ സംവേദനക്ഷമതയുടെ ഗുണവും ഒമിക്സ് സമീപനങ്ങൾക്കുണ്ട്. മനുഷ്യ അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളിലെ ഫൈബർ വൈവിധ്യത്തിന്റെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ, പോസ്റ്റ്-ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ നിയന്ത്രണം പരിശോധിക്കുന്നതിന് ഞങ്ങൾ പൂരക ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനൽ, പ്രോട്ടിയോമിക് വർക്ക്ഫ്ലോകൾ ഉപയോഗിക്കുകയും ഫലങ്ങൾ സംയോജിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു. ആരോഗ്യമുള്ള യുവാക്കളുടെ ഞങ്ങളുടെ കൂട്ടത്തിലെ വാസ്റ്റസ് ലാറ്ററലിസിൽ പ്രോട്ടീൻ തലത്തിൽ ശുദ്ധമായ 2X-തരം നാരുകൾ തിരിച്ചറിയുന്നതിൽ ഈ വർക്ക്ഫ്ലോ പരാജയപ്പെട്ടു. ആരോഗ്യമുള്ള വാസ്റ്റസ് ലാറ്ററലിസിൽ <1% ശുദ്ധമായ 2X നാരുകൾ കണ്ടെത്തിയ മുൻ സിംഗിൾ ഫൈബർ പഠനങ്ങളുമായി ഇത് പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, എന്നിരുന്നാലും ഭാവിയിൽ മറ്റ് പേശികളിൽ ഇത് സ്ഥിരീകരിക്കപ്പെടണം. mRNA ലെവലിൽ ഏതാണ്ട് ശുദ്ധമായ 2X നാരുകളും പ്രോട്ടീൻ ലെവലിൽ മിക്സഡ് 2A/2X നാരുകളും മാത്രം കണ്ടെത്തുന്നതിലെ വ്യത്യാസം അമ്പരപ്പിക്കുന്നതാണ്. MYH ഐസോഫോം mRNA എക്സ്പ്രഷൻ സർക്കാഡിയൻ അല്ല,67 സൂചിപ്പിക്കുന്നത് RNA ലെവലിൽ ശുദ്ധമായ 2X നാരുകളിൽ MYH2 ആരംഭ സിഗ്നൽ നമുക്ക് "നഷ്ടപ്പെട്ടിരിക്കാൻ" സാധ്യതയില്ലെന്ന്. പൂർണ്ണമായും സാങ്കൽപ്പികമാണെങ്കിലും, MYH ഐസോഫോമുകൾക്കിടയിലുള്ള പ്രോട്ടീനിലും/അല്ലെങ്കിൽ mRNA സ്ഥിരതയിലും ഉള്ള വ്യത്യാസങ്ങളായിരിക്കാം ഒരു സാധ്യമായ വിശദീകരണം. തീർച്ചയായും, ഏതെങ്കിലും MYH ഐസോഫോമിന് ഒരു ഫാസ്റ്റ് ഫൈബറും 100% ശുദ്ധമല്ല, കൂടാതെ 70-90% ശ്രേണിയിലെ MYH1 mRNA എക്സ്പ്രഷൻ ലെവലുകൾ പ്രോട്ടീൻ ലെവലിൽ MYH1, MYH2 എന്നിവയ്ക്ക് തുല്യമായ സമൃദ്ധി നൽകുമോ എന്ന് വ്യക്തമല്ല. എന്നിരുന്നാലും, മുഴുവൻ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമോ പ്രോട്ടിയോമോ പരിഗണിക്കുമ്പോൾ, ക്ലസ്റ്റർ വിശകലനത്തിന് അവയുടെ കൃത്യമായ MYH ഘടന പരിഗണിക്കാതെ തന്നെ, മന്ദഗതിയിലുള്ളതും വേഗതയേറിയതുമായ അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന രണ്ട് വ്യത്യസ്ത ക്ലസ്റ്ററുകളെ മാത്രമേ ആത്മവിശ്വാസത്തോടെ തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയൂ. സിംഗിൾ-ന്യൂക്ലിയസ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക് സമീപനങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള വിശകലനങ്ങളുമായി ഇത് പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, ഇത് സാധാരണയായി രണ്ട് വ്യത്യസ്ത മയോണ്യൂക്ലിയർ ക്ലസ്റ്ററുകളെ മാത്രം തിരിച്ചറിയുന്നു. 68, 69, 70 കൂടാതെ, മുൻ പ്രോട്ടിയോമിക് പഠനങ്ങൾ ടൈപ്പ് 2X നാരുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, ഈ നാരുകൾ ബാക്കിയുള്ള ഫാസ്റ്റ് നാരുകളിൽ നിന്ന് വേറിട്ട് കൂട്ടമായി കൂടുന്നില്ല, കൂടാതെ MYH അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള മറ്റ് ഫൈബർ തരങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ വ്യത്യസ്തമായി സമൃദ്ധമായ പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഒരു ചെറിയ എണ്ണം മാത്രമേ കാണിക്കുന്നുള്ളൂ. 14 ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത്, മനുഷ്യന്റെ അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളെ MYH അടിസ്ഥാനമാക്കി മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത ക്ലാസുകളായിട്ടല്ല, മറിച്ച് അവയുടെ ഉപാപചയ, സങ്കോച ഗുണങ്ങളെ അടിസ്ഥാനമാക്കി രണ്ട് ക്ലസ്റ്ററുകളായി വിഭജിച്ച പേശി നാരുകളുടെ വർഗ്ഗീകരണത്തെക്കുറിച്ചുള്ള 20-ാം നൂറ്റാണ്ടിന്റെ ആദ്യകാല വീക്ഷണത്തിലേക്ക് നാം മടങ്ങണം എന്നാണ്. 63
കൂടുതൽ പ്രധാനമായി, മയോഫൈബർ വൈവിധ്യത്തെ ഒന്നിലധികം മാനങ്ങളിൽ പരിഗണിക്കണം. മുൻ "ഒമിക്സ്" പഠനങ്ങൾ ഈ ദിശയിലേക്ക് വിരൽ ചൂണ്ടിയിട്ടുണ്ട്, അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകൾ വ്യതിരിക്തമായ ക്ലസ്റ്ററുകൾ രൂപപ്പെടുത്തുന്നില്ല, മറിച്ച് ഒരു തുടർച്ചയിൽ ക്രമീകരിച്ചിരിക്കുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. 11, 13, 14, 64, 71 ഇവിടെ, അസ്ഥികൂട പേശിയുടെ സങ്കോചപരവും ഉപാപചയവുമായ ഗുണങ്ങളിലെ വ്യത്യാസങ്ങൾക്ക് പുറമേ, സെൽ-സെൽ ഇടപെടലുകളുമായും വിവർത്തന സംവിധാനങ്ങളുമായും ബന്ധപ്പെട്ട സവിശേഷതകളാൽ മയോഫൈബറുകളെ വേർതിരിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. വാസ്തവത്തിൽ, മന്ദഗതിയിലുള്ളതും വേഗതയേറിയതുമായ ഫൈബർ തരങ്ങളിൽ നിന്ന് സ്വതന്ത്രമായ വൈവിധ്യത്തിന് കാരണമാകുന്ന അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളിൽ റൈബോസോം വൈവിധ്യം ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. മന്ദഗതിയിലുള്ളതും വേഗതയേറിയതുമായ ഫൈബർ തരത്തിൽ നിന്ന് സ്വതന്ത്രമായ ഈ ഗണ്യമായ മയോഫൈബർ വൈവിധ്യത്തിന്റെ അടിസ്ഥാന കാരണം വ്യക്തമല്ല, പക്ഷേ ഇത് പേശി ഫാസിക്കിളുകൾക്കുള്ളിലെ പ്രത്യേക സ്പേഷ്യൽ ഓർഗനൈസേഷനിലേക്ക് വിരൽ ചൂണ്ടാം, പേശി സൂക്ഷ്മ പരിസ്ഥിതിയിലെ മറ്റ് കോശ തരങ്ങളുമായുള്ള പ്രത്യേക സെല്ലുലാർ അല്ലെങ്കിൽ അവയവ-നിർദ്ദിഷ്ട ആശയവിനിമയം73,74,75 അല്ലെങ്കിൽ വ്യക്തിഗത മയോഫൈബറുകളിലെ റൈബോസോം പ്രവർത്തനത്തിലെ വ്യത്യാസങ്ങൾ73,74,75. തീർച്ചയായും, RPL3, RPL3L എന്നിവയുടെ പാരലോഗസ് സബ്സ്റ്റിറ്റ്യൂഷൻ വഴിയോ അല്ലെങ്കിൽ rRNA യുടെ 2′O-മീഥൈലേഷൻ തലത്തിലോ റൈബോസോമൽ ഹെറ്ററോപ്ലാസ്മി, അസ്ഥികൂട പേശി ഹൈപ്പർട്രോഫിയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. വ്യക്തിഗത മയോഫൈബറുകളുടെ പ്രവർത്തനപരമായ സ്വഭാവസവിശേഷതകളുമായി സംയോജിപ്പിച്ച മൾട്ടി-ഒമിക്, സ്പേഷ്യൽ ആപ്ലിക്കേഷനുകൾ മൾട്ടി-ഒമിക് തലത്തിൽ പേശി ജീവശാസ്ത്രത്തെക്കുറിച്ചുള്ള നമ്മുടെ ഗ്രാഹ്യത്തെ കൂടുതൽ മെച്ചപ്പെടുത്തും78.
നെമാലിൻ മയോപ്പതി ബാധിച്ച രോഗികളിൽ നിന്നുള്ള സിംഗിൾ മയോഫൈബറുകളുടെ പ്രോട്ടിയോമുകൾ വിശകലനം ചെയ്തുകൊണ്ട്, അസ്ഥികൂട പേശികളുടെ ക്ലിനിക്കൽ പാത്തോഫിസിയോളജി വ്യക്തമാക്കുന്നതിന് സിംഗിൾ മയോഫൈബർ പ്രോട്ടിയോമിക്സിന്റെ പ്രയോജനം, ഫലപ്രാപ്തി, പ്രയോഗക്ഷമത എന്നിവയും ഞങ്ങൾ തെളിയിച്ചു. മാത്രമല്ല, ഞങ്ങളുടെ വർക്ക്ഫ്ലോയെ ആഗോള പ്രോട്ടിയോമിക് വിശകലനവുമായി താരതമ്യം ചെയ്തുകൊണ്ട്, സിംഗിൾ മയോഫൈബർ പ്രോട്ടിയോമിക്സ് ആഗോള ടിഷ്യു പ്രോട്ടിയോമിക്സിന്റെ അതേ ആഴത്തിലുള്ള വിവരങ്ങൾ നൽകുന്നുവെന്നും ഇന്റർഫൈബർ വൈവിധ്യവും മയോഫൈബർ തരവും കണക്കിലെടുത്ത് ഈ ആഴം വിപുലീകരിക്കുന്നുവെന്നും ഞങ്ങൾക്ക് തെളിയിക്കാൻ കഴിഞ്ഞു. ആരോഗ്യകരമായ നിയന്ത്രണങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ACTA1, TNNT1 നെമാലൈൻ മയോപ്പതികളിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്ന ഫൈബർ തരം അനുപാതത്തിലെ പ്രതീക്ഷിക്കുന്ന (വേരിയബിൾ ആണെങ്കിലും) വ്യത്യാസങ്ങൾക്ക് പുറമേ,19 MYH- മധ്യസ്ഥതയുള്ള ഫൈബർ തരം സ്വിച്ചിംഗിൽ നിന്ന് സ്വതന്ത്രമായി ഓക്സിഡേറ്റീവ്, എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ പുനർനിർമ്മാണവും ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു. TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതികളിൽ ഫൈബ്രോസിസ് മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.19 എന്നിരുന്നാലും, ACTA1, TNNT1 നെമാലിൻ മയോപ്പതികൾ ഉള്ള രോഗികളിൽ നിന്നുള്ള മയോഫൈബറുകളിൽ, സാർകോലെമ്മൽ റിപ്പയർ മെക്കാനിസങ്ങളിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന അനെക്സിനുകൾ പോലുള്ള എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ സ്രവിക്കുന്ന സമ്മർദ്ദവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പ്രോട്ടീനുകളുടെ വർദ്ധിച്ച അളവ് വെളിപ്പെടുത്തുന്നതിലൂടെ ഞങ്ങളുടെ വിശകലനം ഈ കണ്ടെത്തലിനെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്.57,58,59 ഉപസംഹാരമായി, നെമാലിൻ മയോപ്പതി ഉള്ള രോഗികളിൽ നിന്നുള്ള മയോഫൈബറുകളിൽ വർദ്ധിച്ച അനെക്സിൻ അളവ് ഗുരുതരമായ അട്രോഫിക് മയോഫൈബറുകൾ നന്നാക്കുന്നതിനുള്ള സെല്ലുലാർ പ്രതികരണത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കാം.
മനുഷ്യരുടെ ഇതുവരെയുള്ള ഏറ്റവും വലിയ സിംഗിൾ-ഫൈബർ ഹോൾ-മസിൽ-ഒമിക്സ് വിശകലനത്തെയാണ് ഈ പഠനം പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നതെങ്കിലും, ഇതിന് പരിമിതികളില്ല. പങ്കെടുക്കുന്നവരുടെ താരതമ്യേന ചെറുതും ഏകതാനവുമായ ഒരു സാമ്പിളിൽ നിന്നും ഒരൊറ്റ പേശിയിൽ നിന്നും (വാസ്റ്റസ് ലാറ്ററലിസ്) ഞങ്ങൾ അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളെ വേർതിരിച്ചു. അതിനാൽ, പേശി തരങ്ങളിലുടനീളവും പേശി ശരീരശാസ്ത്രത്തിന്റെ അങ്ങേയറ്റങ്ങളിലും നിർദ്ദിഷ്ട ഫൈബർ പോപ്പുലേഷന്റെ നിലനിൽപ്പ് ഒഴിവാക്കുക അസാധ്യമാണ്. ഉദാഹരണത്തിന്, ഉയർന്ന പരിശീലനം ലഭിച്ച സ്പ്രിന്ററുകളിലും/അല്ലെങ്കിൽ ശക്തി അത്‌ലറ്റുകളിലും79 അല്ലെങ്കിൽ പേശി നിഷ്‌ക്രിയത്വത്തിന്റെ കാലഘട്ടങ്ങളിൽ66,80 അൾട്രാഫാസ്റ്റ് നാരുകളുടെ (ഉദാഹരണത്തിന്, ശുദ്ധമായ 2X നാരുകൾ) ഒരു ഉപവിഭാഗം ഉയർന്നുവരാനുള്ള സാധ്യത ഞങ്ങൾക്ക് തള്ളിക്കളയാനാവില്ല. കൂടാതെ, ഫൈബർ തരം അനുപാതങ്ങൾ പുരുഷന്മാരും സ്ത്രീകളും തമ്മിൽ വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരിക്കുന്നതായി അറിയപ്പെടുന്നതിനാൽ, പങ്കെടുക്കുന്നവരുടെ പരിമിതമായ സാമ്പിൾ വലുപ്പം ഫൈബർ വൈവിധ്യത്തിലെ ലിംഗ വ്യത്യാസങ്ങൾ അന്വേഷിക്കുന്നതിൽ നിന്ന് ഞങ്ങളെ തടഞ്ഞു. കൂടാതെ, ഒരേ പേശി നാരുകളിലോ ഒരേ പങ്കാളികളിൽ നിന്നുള്ള സാമ്പിളുകളിലോ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക്, പ്രോട്ടിയോമിക് വിശകലനങ്ങൾ നടത്താൻ ഞങ്ങൾക്ക് കഴിഞ്ഞില്ല. നമ്മളും മറ്റുള്ളവരും ഒമിക്സ് വിശകലനം ഉപയോഗിച്ച് സിംഗിൾ-സെൽ, സിംഗിൾ-മയോഫൈബർ വിശകലനങ്ങൾ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുന്നത് തുടരുമ്പോൾ, അൾട്രാ-ലോ സാമ്പിൾ ഇൻപുട്ട് നേടുന്നതിന് (മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മയോപ്പതി രോഗികളിൽ നിന്നുള്ള നാരുകളുടെ വിശകലനത്തിൽ ഇവിടെ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ), ഒറ്റ പേശി നാരുകൾക്കുള്ളിൽ മൾട്ടി-ഒമിക്സ് (ഫങ്ഷണൽ) സമീപനങ്ങൾ സംയോജിപ്പിക്കാനുള്ള അവസരം വ്യക്തമാകും.
മൊത്തത്തിൽ, ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ അസ്ഥികൂട പേശി വൈവിധ്യത്തിന്റെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ, പോസ്റ്റ്-ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ ഡ്രൈവറുകളെ തിരിച്ചറിയുകയും വിശദീകരിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. പ്രത്യേകിച്ചും, ഫൈബർ തരങ്ങളുടെ ക്ലാസിക്കൽ MYH അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള നിർവചനവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട അസ്ഥികൂട പേശി ശരീരശാസ്ത്രത്തിലെ ദീർഘകാല സിദ്ധാന്തത്തെ വെല്ലുവിളിക്കുന്ന ഡാറ്റ ഞങ്ങൾ അവതരിപ്പിക്കുന്നു. ചർച്ച പുതുക്കാനും ഒടുവിൽ അസ്ഥികൂട പേശി നാരുകളുടെ വർഗ്ഗീകരണത്തെയും വൈവിധ്യത്തെയും കുറിച്ചുള്ള നമ്മുടെ ധാരണയെ പുനർവിചിന്തനം ചെയ്യാനും ഞങ്ങൾ പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു.
പതിനാല് കൊക്കേഷ്യൻ പങ്കാളികൾ (12 പുരുഷന്മാരും 2 സ്ത്രീകളും) ഈ പഠനത്തിൽ പങ്കെടുക്കാൻ സ്വമേധയാ സമ്മതിച്ചു. ഗെന്റ് യൂണിവേഴ്സിറ്റി ഹോസ്പിറ്റലിന്റെ (BC-10237) എത്തിക്സ് കമ്മിറ്റി ഈ പഠനത്തിന് അംഗീകാരം നൽകി, 2013 ലെ ഹെൽസിങ്കി ഡിക്ലറേഷൻ അനുസരിച്ചാണ് ഇത് ചെയ്തത്, കൂടാതെ ClinicalTrials.gov (NCT05131555) ൽ രജിസ്റ്റർ ചെയ്തു. പങ്കെടുക്കുന്നവരുടെ പൊതു സവിശേഷതകൾ അനുബന്ധ പട്ടിക 1 ൽ അവതരിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. വാക്കാലുള്ളതും രേഖാമൂലമുള്ളതുമായ സമ്മതം നേടിയ ശേഷം, പഠനത്തിൽ അന്തിമമായി ഉൾപ്പെടുത്തുന്നതിന് മുമ്പ് പങ്കെടുക്കുന്നവർ ഒരു മെഡിക്കൽ പരിശോധനയ്ക്ക് വിധേയരായി. പങ്കെടുക്കുന്നവർ ചെറുപ്പമായിരുന്നു (22–42 വയസ്സ്), ആരോഗ്യമുള്ളവർ (വൈദ്യപ്രശ്നങ്ങളില്ല, പുകവലി ചരിത്രമില്ല), മിതമായ ശാരീരികമായി സജീവമായിരുന്നു. മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ ശാരീരിക ക്ഷമത വിലയിരുത്തുന്നതിന് ഒരു സ്റ്റെപ്പ് എർഗോമീറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് പരമാവധി ഓക്സിജൻ ആഗിരണം നിർണ്ണയിച്ചു. 81
വിശ്രമത്തിലും ഉപവാസാവസ്ഥയിലും 14 ദിവസത്തെ ഇടവേളയിൽ മൂന്ന് തവണ പേശി ബയോപ്സി സാമ്പിളുകൾ ശേഖരിച്ചു. ഒരു വലിയ പഠനത്തിന്റെ ഭാഗമായി ഈ സാമ്പിളുകൾ ശേഖരിച്ചതിനാൽ, പങ്കെടുക്കുന്നവർ ബയോപ്സിക്ക് 40 മിനിറ്റ് മുമ്പ് പ്ലാസിബോ (ലാക്ടോസ്), ഒരു H1-റിസപ്റ്റർ ആന്റഗോണിസ്റ്റ് (540 mg ഫെക്സോഫെനാഡിൻ), അല്ലെങ്കിൽ ഒരു H2-റിസപ്റ്റർ ആന്റഗോണിസ്റ്റ് (40 mg ഫാമോട്ടിഡിൻ) എന്നിവ കഴിച്ചു. ഈ ഹിസ്റ്റാമിൻ റിസപ്റ്റർ ആന്റഗോണിസ്റ്റുകൾ അസ്ഥികൂട പേശികളുടെ വിശ്രമത്തെ ബാധിക്കുന്നില്ലെന്ന് ഞങ്ങൾ മുമ്പ് തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്, കൂടാതെ ഞങ്ങളുടെ ഗുണനിലവാര നിയന്ത്രണ പ്ലോട്ടുകളിൽ സംസ്ഥാനവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ക്ലസ്റ്ററിംഗ് ഒന്നും നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടില്ല (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രങ്ങൾ 3 ഉം 6 ഉം). ഓരോ പരീക്ഷണ ദിവസത്തിനും 48 മണിക്കൂർ മുമ്പ് ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡയറ്റ് (41.4 kcal/kg ശരീരഭാരം, 5.1 g/kg ശരീരഭാരം കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ്, 1.4 g/kg ശരീരഭാരം പ്രോട്ടീൻ, 1.6 g/kg ശരീരഭാരം കൊഴുപ്പ്) എന്നിവ നിലനിർത്തി, പരീക്ഷണ ദിവസത്തിന്റെ രാവിലെ ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ് പ്രഭാതഭക്ഷണം (1.5 g/kg ശരീരഭാരം കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ്) കഴിച്ചു. ലോക്കൽ അനസ്തേഷ്യയിൽ (എപിനെഫ്രിൻ ഇല്ലാതെ 0.5 മില്ലി 1% ലിഡോകൈൻ), പെർക്യുട്ടേനിയസ് ബെർഗ്സ്ട്രോം ആസ്പിറേഷൻ ഉപയോഗിച്ച് വാസ്റ്റസ് ലാറ്ററലിസ് പേശിയിൽ നിന്ന് പേശി ബയോപ്സികൾ എടുത്തു. 82 പേശി സാമ്പിളുകൾ ഉടൻ തന്നെ ആർ‌എൻ‌എയിൽ ഉൾപ്പെടുത്തി മാനുവൽ ഫൈബർ ഡിസെക്ഷൻ വരെ (3 ദിവസം വരെ) 4°C ൽ സൂക്ഷിച്ചു.
പുതുതായി വേർതിരിച്ചെടുത്ത മയോഫൈബർ ബണ്ടിലുകൾ ഒരു കൾച്ചർ ഡിഷിൽ പുതിയ RNA ലേറ്റർ മീഡിയത്തിലേക്ക് മാറ്റി. സ്റ്റീരിയോമൈക്രോസ്കോപ്പും ഫൈൻ ട്വീസറുകളും ഉപയോഗിച്ച് വ്യക്തിഗത മയോഫൈബറുകൾ സ്വമേധയാ വിച്ഛേദിച്ചു. ഓരോ ബയോപ്സിയിൽ നിന്നും ഇരുപത്തിയഞ്ച് നാരുകൾ വേർതിരിച്ചെടുത്തു, ബയോപ്സിയുടെ വിവിധ ഭാഗങ്ങളിൽ നിന്ന് നാരുകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിൽ പ്രത്യേക ശ്രദ്ധ ചെലുത്തി. വിച്ഛേദിച്ചതിനുശേഷം, അനാവശ്യ പ്രോട്ടീനുകളും ഡിഎൻഎയും നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി പ്രോട്ടീനേസ് കെ, ഡിഎൻഎ എൻസൈമുകൾ അടങ്ങിയ 3 μl ലൈസിസ് ബഫറിൽ (സിംഗിൾഷോട്ട് സെൽ ലൈസിസ് കിറ്റ്, ബയോ-റാഡ്) ഓരോ നാരുകളും സൌമ്യമായി മുക്കി. പിന്നീട് സെൽ ലൈസിസും പ്രോട്ടീൻ/ഡിഎൻഎ നീക്കം ചെയ്യലും ഹ്രസ്വമായ വോർടെക്സിംഗ്, മൈക്രോസെൻട്രിഫ്യൂജിൽ ദ്രാവകം കറക്കൽ, മുറിയിലെ താപനിലയിൽ (10 മിനിറ്റ്) ഇൻകുബേഷൻ എന്നിവയിലൂടെ ആരംഭിച്ചു. തുടർന്ന് ലൈസേറ്റ് ഒരു തെർമൽ സൈക്ലറിൽ (T100, ബയോ-റാഡ്) 37°C യിൽ 5 മിനിറ്റും 75°C യിൽ 5 മിനിറ്റും ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് കൂടുതൽ പ്രോസസ്സിംഗ് വരെ -80°C യിൽ ഉടൻ സൂക്ഷിച്ചു.
ക്വാണ്ട്‌സെക്-പൂൾ 3′ mRNA-Seq ലൈബ്രറി പ്രെപ്പ് കിറ്റ് (ലെക്‌സോജൻ) ഉപയോഗിച്ച് 2 µl മയോഫൈബർ ലൈസേറ്റിൽ നിന്നാണ് ഇല്ലുമിന-അനുയോജ്യമായ പോളിഡെനൈലേറ്റഡ് ആർ‌എൻ‌എ ലൈബ്രറികൾ തയ്യാറാക്കിയത്. നിർമ്മാതാവിന്റെ മാനുവലിൽ വിശദമായ രീതികൾ കാണാം. റിവേഴ്‌സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ വഴിയുള്ള ഫസ്റ്റ്-സ്ട്രാൻഡ് സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസിലാണ് പ്രക്രിയ ആരംഭിക്കുന്നത്, ഈ സമയത്ത് സാമ്പിളുകളുടെ പൂളിംഗ് ഉറപ്പാക്കുന്നതിനും ഡൗൺസ്ട്രീം പ്രോസസ്സിംഗ് സമയത്ത് സാങ്കേതിക വ്യതിയാനം കുറയ്ക്കുന്നതിനും അതുല്യമായ മോളിക്യുലാർ ഐഡന്റിഫയറുകളും (UMI-കൾ) സാമ്പിൾ-നിർദ്ദിഷ്ട i1 ബാർകോഡുകളും അവതരിപ്പിക്കുന്നു. 96 മയോഫൈബറുകളിൽ നിന്നുള്ള സിഡിഎൻഎ പിന്നീട് മാഗ്നറ്റിക് ബീഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് പൂൾ ചെയ്ത് ശുദ്ധീകരിക്കുന്നു, അതിനുശേഷം ആർ‌എൻ‌എ നീക്കം ചെയ്യുകയും റാൻഡം പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് സെക്കൻഡ്-സ്ട്രാൻഡ് സിന്തസിസ് നടത്തുകയും ചെയ്യുന്നു. ലൈബ്രറി മാഗ്നറ്റിക് ബീഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ശുദ്ധീകരിക്കുന്നു, പൂൾ-നിർദ്ദിഷ്ട i5/i7 ടാഗുകൾ ചേർക്കുന്നു, പി‌സി‌ആർ ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്യുന്നു. ഒരു അന്തിമ ശുദ്ധീകരണ ഘട്ടം ഇല്ലുമിന-അനുയോജ്യമായ ലൈബ്രറികൾ നിർമ്മിക്കുന്നു. ഓരോ ലൈബ്രറി പൂളിന്റെയും ഗുണനിലവാരം ഹൈ സെൻസിറ്റിവിറ്റി സ്മോൾ ഫ്രാഗ്മെന്റ് ഡിഎൻഎ അനാലിസിസ് കിറ്റ് (എജിലന്റ് ടെക്നോളജീസ്, DNF-477-0500) ഉപയോഗിച്ച് വിലയിരുത്തി.
ക്യൂബിറ്റ് ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷന്റെ അടിസ്ഥാനത്തിൽ, പൂളുകളെ തുല്യമോളാർ സാന്ദ്രതയിൽ (2 nM) കൂടുതൽ പൂൾ ചെയ്തു. തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന പൂൾ പിന്നീട് 2 nM ലോഡിംഗ് (4% PhiX) ഉപയോഗിച്ച് NovaSeq S2 റീജന്റ് കിറ്റ് (1 × 100 ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ) ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റാൻഡേർഡ് മോഡിൽ ഒരു NovaSeq 6000 ഉപകരണത്തിൽ ക്രമീകരിച്ചു.
ഞങ്ങളുടെ പൈപ്പ്‌ലൈൻ ലെക്‌സോജന്റെ QuantSeq പൂൾ ഡാറ്റ വിശകലന പൈപ്പ്‌ലൈനിനെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ് (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). i7/i5 സൂചികയെ അടിസ്ഥാനമാക്കി bcl2fastq2 (v2.20.0) ഉപയോഗിച്ച് ഡാറ്റ ആദ്യം ഡീമൾട്ടിപ്ലക്‌സ് ചെയ്‌തു. i1 സാമ്പിൾ ബാർകോഡിനെ അടിസ്ഥാനമാക്കി റീഡ് 2 പിന്നീട് ഐഡെമക്സ് (v0.1.6) ഉപയോഗിച്ച് ഡീമൾട്ടിപ്ലക്‌സ് ചെയ്‌തു, umi_tools (v1.0.1) ഉപയോഗിച്ച് UMI സീക്വൻസുകൾ എക്‌സ്‌ട്രാക്‌റ്റ് ചെയ്‌തു. ഹ്രസ്വ റീഡുകൾ (<20 നീളം) അല്ലെങ്കിൽ അഡാപ്റ്റർ സീക്വൻസുകൾ മാത്രം ഉൾക്കൊള്ളുന്ന റീഡുകൾ നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി ഒന്നിലധികം റൗണ്ടുകളിലായി കട്ടഡാപ്റ്റ് (v3.4) ഉപയോഗിച്ച് റീഡുകൾ ട്രിം ചെയ്‌തു. തുടർന്ന് STAR (v2.6.0c) ഉപയോഗിച്ച് മനുഷ്യ ജീനോമിലേക്ക് റീഡുകൾ വിന്യസിച്ചു, BAM ഫയലുകൾ SAMtools (v1.11) ഉപയോഗിച്ച് ഇൻഡെക്‌സ് ചെയ്‌തു. umi_tools (v1.0.1) ഉപയോഗിച്ച് ഡ്യൂപ്ലിക്കേറ്റ് റീഡുകൾ നീക്കം ചെയ്‌തു. ഒടുവിൽ, സബ്‌റീഡിലെ ഫീച്ചർ കൗണ്ട്‌സ് ഉപയോഗിച്ച് അലൈൻമെന്റ് കൗണ്ടിംഗ് നടത്തി (v2.0.3). പൈപ്പ്‌ലൈനിന്റെ നിരവധി ഇന്റർമീഡിയറ്റ് ഘട്ടങ്ങളിൽ FastQC (v0.11.9) ഉപയോഗിച്ച് ഗുണനിലവാര നിയന്ത്രണം നടത്തി.
തുടർന്നുള്ള എല്ലാ ബയോഇൻഫോർമാറ്റിക്സ് പ്രോസസ്സിംഗും വിഷ്വലൈസേഷനും R (v4.2.3) ൽ നടത്തി, പ്രാഥമികമായി Seurat (v4.4.0) വർക്ക്ഫ്ലോ ഉപയോഗിച്ചു. 83 അതിനാൽ, വ്യക്തിഗത UMI മൂല്യങ്ങളും മെറ്റാഡാറ്റ മാട്രിക്സുകളും Seurat ഒബ്ജക്റ്റുകളായി രൂപാന്തരപ്പെട്ടു. എല്ലാ ഫൈബറുകളിലും 30% ൽ താഴെ പ്രകടിപ്പിച്ച ജീനുകൾ നീക്കം ചെയ്തു. 1000 UMI മൂല്യങ്ങളുടെയും കണ്ടെത്തിയ 1000 ജീനുകളുടെയും ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ പരിധി അടിസ്ഥാനമാക്കി, താഴ്ന്ന നിലവാരമുള്ള സാമ്പിളുകൾ നീക്കം ചെയ്തു. ഒടുവിൽ, 925 നാരുകൾ എല്ലാ ഗുണനിലവാര നിയന്ത്രണ ഫിൽട്ടറിംഗ് ഘട്ടങ്ങളും കടന്നുപോയി. Seurat SCTransform v2 രീതി ഉപയോഗിച്ച് UMI മൂല്യങ്ങൾ സാധാരണവൽക്കരിച്ചു, കണ്ടെത്തിയ 7418 സവിശേഷതകളും ഉൾപ്പെടെ 84 എണ്ണം, പങ്കാളികൾ തമ്മിലുള്ള വ്യത്യാസങ്ങൾ പിൻവലിച്ചു. എല്ലാ പ്രസക്തമായ മെറ്റാഡാറ്റയും സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റാസെറ്റ് 28 ൽ കാണാം.